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ダイオキシン受容体は、リガンドであるダイオキシン類が結合して初めて標的遺伝子の調節DNA配列に結合する。本研究ではこの性質を利用することにした。リガンドであるダイオキシン様物質の存在に応答して受容体が結合した標的DNA配列を、タグ付き受容体の精製を通して単離し、PCRにて増幅させる。これによって、試料中にごく微量でも存在するダイオキシン類を間接的に検出するという手法である。
(発現遺伝子の構築)
ダイオキシン受容体AhR、および、共役受容体ArntをコードするcDNAを鋳型として、リガンド結合、および、二量体化に必要なN末領域をコードするDNA断片をPCRクローニングした。AhRにのみHisタグを付加した上で、酵母内強制発現ベクターへ両受容体DNAをサブクローニングした。さらに、これらの発現遺伝子の両端にアミノ酸合成に関与する遺伝子の一部を付加させた。
(組換え酵母の作出)
構築した発現遺伝子のうち、Arntの発現遺伝子断片を酵母に導入し、現在、組換え酵母の選抜を行っているところである。得られた酵母には、さらにAhRの発現遺伝子断片を導入する予定である。
(標的DNA配列を持つプラスミドの作製)
AhR、および、Arntのヘテロダイマーが結合する標的DNA配列を持たせたプラスミドを作製した。これと、標的配列を持たないもう一つのプラスミドをAhRおよびArntを発現する組換え酵母に保持させる予定である。
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