ATPアナログ認識可能な変異MAPキナーゼを利用したリン酸化基質の探索

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14658201
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 仁科 博史 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (60212122)
• 研究分担者: 荒木 保弘 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (60345254) ; 星野 真一 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 講師 (40219168) ; 堅田 利明 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (10088859)
• キーワード: リン酸化酵素 / ATPアナログ / MAPキナーゼ / JNK / p38 / アポトーシス / ストレス / 紫外線

研究概要

ERK、SAPK/JNK、p38の3種に大別されるMAPキナーゼファミリーは、様々な細胞応答に関与する主要なリン酸化酵素である。申請者らは最近、紫外線照射時のERKやJNK、p38の活性化機構やその生理的役割を検討し、ERKの活性化にはSrcからのEGF受容体の活性化という細胞膜近傍での反応が必要であること、また細胞のアポトーシス誘導の関与が示唆されているJNKやp38とは対照的に、ERKが抗アポトーシスに関与することを明らかにした(J.Biol.Chem.277;366-371,2002)。しかしながら、これらのMAPキナーゼが標的とするリン酸化分子やそれらの生理的役割については不明のままである。一般に、細胞内あるいは細胞抽出液内に存在するプロテインキナーゼの標的分子を同定することは困難な場合が多い。この原因の一つは、共存する多数多種類のキナーゼが一斉にリン酸化反応を行い、目的のリン酸化反応を覆い隠してしまうことにある。そこで本研究では、放射標識された非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子に放射標識されたγ位のリン酸基を転移できるような実験系の開発を行った。これまでに野生型リン酸化酵素が利用できない非天然型ATPアナログを利用可能な点変異JNKは作製済みであり、同様な方法で、p38やERKの点変異体も作製した。現在これら変異体の特性を検討中である。また、細胞膜を透過しにくい非天然型ATPアナログを細胞内に導入する目的で、刺激依存的にJNKが活性化される環境を保持しつつ、非天然型ATPアナログが細胞内に取り込まれる条件を、各種可溶化剤やサポニンを用いて検討中である。

研究成果

• [文献書誌] D.Kitagawa, S.Tanemura, S.Ohata, N.Shimizu, J.Seo, G.Nishitai, et al.: "Activation of extracellular signal-regulated kinase by ultraviolet is mediated through Src-dependent epidermal growth factor receptor phosphorylation"J.Biol.Chem.. 277. 366-371 (2002)
• [文献書誌] T.Watanabe, K.Nakagawa, S.Ohata, D.Kitagawa, G.Nishitai, et al.: "SEK1/MKK4-mediated SAPK/JNK signaling participates in embryonic hepatoblast proliferation via a pathway different from NF-kappaB-induced anti-apoptosis"Dev.Biol.. 15. 332-347 (2002)
• [文献書誌] K.Kontani, M.Tada, T.Ogawa, T.Okai, K.Saito, Y.Araki, T.Katada: "Di-Ras : A distinct subgroup of Ras-family GTPases with unique biochemical properties"J.Biol.Chem.. 277. 41070-41078 (2002)
• [文献書誌] K.Saito, J.Murai, H.Kajiho, K.Kontani, H.Kurosu, T.Katada: "A novel binding protein composed of homophilic tetramer exhibits unique properties for the small GTPase Rab5"J.Biol.Chem.. 277. 3412-3418 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, T.Miyazaki, Y.Kadono, H.Takayanagi, et al.: "Possible Involvement of IκB Kinase 2 and MKK7 in Osteoclastogenesis Induced by Receptor Activator of Nuclear factor κB Ligand"J.Bone Miner.Res.. 17. 612-621 (2002)
• [文献書誌] H.Takayanagi, S.Kim, T.Koga, H.Nishina, et al.: "Induction and Activation of the Transcription Factor NFATc1 (NFAT2) Integrate RANKL Signaling"Dev.Cell. 3. 889-901 (2002)