アミノアシルtRNA合成酵素―tRNAネットワークにおける翻訳精度維持機構の研究

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14658221
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 鈴木 勉 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 講師 (20292782)
• キーワード: ミトコンドリア / tRNA / アミノアシルtRNA合成酵素 / tRNAアイデンティティー

研究概要

tRNAが正しいアミノ酸を受容する過程(アミノアシル化)において、個々のtRNAには対応するアミノアシルtRNA合成酵素にのみ認識されるための配列的、構造的な特徴からなる「tRNAアイデンティティー」が備わっており、1種類のアミノ酸のみを受容し、他の19種類のアミノ酸の取り込みを排除することができる。これまでの考えでは、このtRNAアイデンティティーこそが翻訳精度を維持するための要であると信じられてきた。ところが、最近我々はいくつかのミトコンドリアtRNAが他のアミノ酸を効率よく受容することを見出し、本研究では翻訳精度を維持するための新しい概念である「反応速度論的識別機構(kinetic discrimination)」を提唱し証明することをめざしている。
今年度は、すでにクローニングと組換え酵素の取得に成功している6種類のヒトミトコンドリアアミノアシルtRNA合成酵素に加え、残りの、13種類全ての酵素の発現系の構築を手がけている。ESTデータベースよりヒトミトコンドリアアミノアシルtRNA合成酵素候補遺伝子の推定を行い、ヒトmRNAより逆転写PCRとnested PCRを組み合わせることにより、13種類全てのミトコンドリアアミノアシルtRNA合成酵素候補遺伝子の増幅に成功した。N末にはミトコンドリア移行シグナルがあるため、多種生物由来ホモログとの配列の比較などから、成熟体のN末を予測し、T7系の発現ベクターに組み込んだ。PCRによる塩基置換は部位特異的変異導入により修復した。レアコドンの影響を排除するため、大腸菌株は全て、BL21(DE3)codon plus Rossettaを用いた。発現条件は、IPTGの濃度(0-100μM)と発現誘導後の培養温度(15-37℃)を検討したところ、GluRS、AlaRS、HisRSが可溶性タンパク質として得られた。このうち、HisRS、GluRS、AlaRSに関しては活性を確認し、現在大量精製の条件を検討している。他の候補遺伝子に関しても引き続き、発現条件の確認を進める予定である。

研究成果

• [文献書誌] Suzuki, T., Suzuki, T.^*, Wada, T., Saigo, K., Watanabe, K.: "Taurine as a constituent of mitochondrial tRNAs : New insights into the functions of taurine and human mitochondrial diseases"EMBO Journal. 21. 6581-6589 (2002)
• [文献書誌] Kaneko, T., Suzuki, T., Kapushoc, S.T., Rubio, M.A., Ghazvini, J., Watanabe, K., Simpson, L., Suzuki.T.^*: "Wobble modification differences and subcellular localization of tRNAs in Leishmania tarentolae : implication for tRNA sorting mechanism"EMBO Journal. 22. 657-667 (2003)
• [文献書誌] Tomari, Y., Hino, N., Nagaike, T., Suzuki, T^*, Ueda, T.: "Decreased CCA-addition of human mitochondrial tRNAs bearing pathogenic A4317G or A10044G mutation"J.Biol.Chem.. 278(In press). (2003)
• [文献書誌] Toompuu, M., Yasukawa, T., Suzuki, T., Hakkinen, T., Spelbrink, J.N., Watanabe, K., Jacobs.H.T.: "The 7472insC mitochondrial DNA mutation impairs the synthesis and extent of aminoacylation of tRNA^<Ser>(UCN) but not-its structure or rate of turnover"J.Biol.Chem.. 277. 22240-22250 (2002)
• [文献書誌] Shigi, N., Suzuki, T., Tamakoshi, M., Oshima, T., Watanabe, K.: "The conserved bases in TΨC loop of tRNA are determinants for Thermophile-specific 2-thiolation of U54"J.Biol.Chem.. 277. 39128-39135 (2002)
• [文献書誌] Cho, H.D., Tomita, K., Suzuki, T., Weiner, A.M.: "U2 snRNA is a substrate for the CCA-adding enzyme (tRNA nucleotidyltransferase)"J.Biol.Chem.. 277. 3447-3455 (2002)
• [文献書誌] Yasukawa, T., Suzuki, T., Ohta, S., Watanabe, K.: "Wobble modification defect suppresses translational activity of tRNAs with MELAS an MERRF mutations"Mitochondrion. 2. 129-141 (2002)
• [文献書誌] 渡辺公綱, 大槻高史, 鈴木 勉: "ミトコンドリアの翻訳システム"蛋白質 核酸 酵素,(3月増刊号)「RNAの細胞生物学」共立出版. 365-374 (2003)
• [文献書誌] 鈴木 勉: "リボソーム(ribosome is ribozyme)(第6章)"わかる実験医学シリーズ「RNAがわかる」羊土社(印刷中). (2003)