有機フッ素化合物のバイオコンバージョン:フッ素脱離・導入の酵素触媒機構と応用

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14703021
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70243087)
• キーワード: 有機フッ素化合物 / フルオロ酢酸 / フルオロ酢酸デハロゲナーゼ / 有機ハロゲン化合物 / 2-ハロ酸 / 2-ハロ酸デハロゲナーゼ / 脱ハロゲン

研究概要

1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼは、脂肪族有機フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の開裂を触媒する唯一の既知酵素である。Burkholderia sp.FA1由来の本酵素の立体構造の解明をめざし、結晶化条件の検討とX線結晶構造解析を行った。T7プロモーター下流に本酵素遺伝子を持つプラスミドをEscherichia coli BL21(DE3)に導入し、培養した。菌体抽出液から、硫安分画、各種クロマトグラフィーによって本酵素を精製し、結晶化条件のスクリーニシグに供した。20%(w/v)PEG-1000、100mM Imidazole pH8.0、200mM Ca(OAc)_2を母液とし、シッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化を行った場合に、板状の単結晶(0.1×0.1mm)が得られた。この結晶にX線を照射したところ、3.5Å分解能のデータ収集が可能であった。二枚の回折像を用いて指数付けを行った結果、斜方晶系または単斜晶系であることが示された。本結晶を高輝度放射光解析に供すれば、本酵素の精密立体構造を明らかにできるものと考えられた。
2.Moraxalla sp.B由来のフルオロ酢酸デハロゲナーゼのAsp105は、基質フルオロ酢酸のα-炭素を求核攻撃し、フッ化物イオンの脱離を引き起こす。このようにAsp105は触媒残基として機能するが、この残基をAsnに改変しても、酵素活性は完全には消失しなかった。また、木変異型酵素の活性は経時的に上昇した。本酵素の構造をイオンスプレー質量分析法によって解析した結果、再活性化は、Asnの脱アミドによるAspの再生によることが明らかとなった。L-2-ハロ酸デハロゲナーゼの触媒中心Asp10をAsnに改変した変異型酵素では、Asn10が求核性の触媒残基として機能したが、フルオロ酢酸デハロゲナーゼの変異型酵素D105NのAsn105は脱ハロゲンを引き起こす求核性の触媒残基としては機能しなかった。

研究成果

• [文献書誌] Kurihara, Tatsuo at al.: "Purification, characterization, and gene cloning of a novel fluoroacetate dehalogenase from Burkholderia sp. FA1"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 347-355 (2003)
• [文献書誌] Li, Yong-Fu et al.: "Mass spectrometric analysis of the reactions catalyzed by L-2-haloacid dehalogenase mutants and implications for the roles of the catalytic amino acid residues"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 337-345 (2003)
• [文献書誌] Park, Chung et al.: "A new DL-2-haloacid dehalogenase acting on 2-haloacid amides : purification, characterization, and mechanism"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 329-336 (2003)
• [文献書誌] Ichiyama, Susumu et al.: "Reactivity of asparagine residue at the active site of the D105N mutant of fluoroacetate dehalogenase from Moraxella sp. B"Biochim.Biophys.Acta. 1698. 27-36 (2004)