液胞へのたんぱく質輪送経路の分子メカニズムの解明〜SNARE分子を中心にして〜

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14740439
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 佐藤 雅彦 京都大学, 大学院・人間・環境学研究科, 助手 (20283575)
• キーワード: シロイヌナズナ / SNARE / GFP / 細胞内小胞

研究概要

シロイヌナズナゲノム中に存在する全SNARE分子の細胞内局在の決定
シロイヌナズナゲノムデータベースよりSNARE分子をコードする遺伝子を54種類同定した。これらを配列の類似性を元にして5種類(Qa,Qb,Qc,R,SNAP)に分類し、それぞれの遺伝子が実際発現しているかを、RT-PCR法を用いて確認した。その結果、R-SNAREの一種であるYKT61を除く、全てのSNAREをコードする遺伝子が何らかの組織で発現していた。これらのSNAREの細胞内での局在を調べるために、mRNAより逆転写酵素によってcDNA合成し、それらを鋳型としてPCR法によりDNAを合成した後、GFP融合タンパク質を発現するためのベクターp35S-GFP/pUCβにGFPの読み枠とイン・フレームになるように結合した。このようにして作成した融合タンパク質発現用ベクターをシロイヌナズナの培養細胞に一過的に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡によって、細胞内局在の観察を行った。
その結果、小胞体に存在するSNAREが6種類、ゴルジ体に局在するSNAREが9種類、トランスゴルジ網に局在するSNAREが8種類、エンドソームには2種類、細胞膜には20種類、液胞膜には9種類のSNAREが、それぞれ存在することが明らかとなった。
この研究により、細胞内小器官全てのSNARE分子の同定に成功した。細胞内小器官の中で、特に細胞膜には多くのSNAREが存在するととが明らかとなったが、これは細胞膜への極性輸送、細胞周期的な発現の違いなどを考えると、それぞれの条件、あるいは輸送経路に特有のSNARE分子があることが予想され、非常に興味深い結果である。
今後、これら細胞膜上のSNAREを発現する遺伝子組み換えシロイヌナズナを用いて、極性輸送と,SNAREの関係について調べていく予定である。

研究成果

• [文献書誌] Ito, K.et al.: "Channel induction by palytoxin in yeast cells expressing Na^+, K^+-ATPase or its chimera with sarco/endoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase."FEBS Letters. 543. 108-112 (2003)
• [文献書誌] Mitsuda, N., Isono, T., Sato,.M.H.: "Arabidopsis CAMTA family proteins enhance V-PPase expression in pollen."Plant and Cell Physiology. 44. 975-981 (2003)
• [文献書誌] Kutsuna, K., Kumagai, F., Sato, M.H., Hasezawa, S.: "Three-dimensional reconstruction of tubular structure of vacuolar membrane throughout in living tobacco cells."Plant and Cell Physiology. 44. 1045-1054 (2003)
• [文献書誌] Yano, D., Sato, M., Saito, M., Sato, M.H., Morita, M.T., Tasaka, M.: "A SNARE complex containing SGR3/AtVAM3 and ZIG/VTI11 in gravity-sensing cells is important for Arabidopsis shoot gravitropism."Proc.Natl.Acad.Aci.U.S.A.. 100. 8589-8594 (2003)