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本研究では、研究代表者が出血性ヘビ毒から見いだした新規血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導タンパク質(VAP)をもとに、生体内で血管内皮細胞のアポトーシスを制御している因子や受容体を見いだし、その構造や作用機序を明らかにすることを目的とする。
本年度は、VAPcDNAのタンパク質発現系の確立及び血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子受容体の検索を試みた。血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子を特定するためには、VAPに共通するアミノ酸配列をもとに得られた血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子の候補タンパク質の発現系を確立し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いてアポトーシス誘導活性を評価することが必要となる。そこで、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子発現系の確立を視野に入れてVAPタンパク質発現系の確立を試みた。昨年度までに大腸菌タンパク質発現系を用いてVAPの発現を試みていたが、効率的に発現誘導出来なかった。本年度は昆虫細胞発現系及びほ乳類発現系を用いてVAPのタンパク質発現条件の検討を行ったところ、昆虫細胞発現系で効率的に発現誘導する条件を決定することが出来た。現在この昆虫細胞発現系を用いてタンパク質発現させ、分離精製条件の検討を行っている。
次に、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子受容体の検索を試みた。これまでの研究の結果からVAPはインテグリンなどを含む特定の膜タンパク質複合体にディスインテグソンドメインを介して結合すると考えられる。そこでVAP受容体の検索にむけて、VAPの活性阻害抗体である抗インテグリン抗体、抗CD9抗体を用いた血管内皮細胞の膜画分の免疫沈降物の解析を行ったが、受容体候補タンパク質は得られなかった。今後さらなる実験方法や条件の検討が必要である。
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