プロテインメモリー現象によるタンパク質の構造変化と保持機構の解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14760064
• 研究機関: 独立行政法人食品総合研究所
• 研究代表者: 韮澤 悟 独立行政法人食品総合研究所, 生物機能開発部, 研究員 (10343823)
• キーワード: 分子内シャペロン / アミノペプチダーゼ / X線結晶構造解析 / キメラ酵素 / プロ酵素 / アミノ酸部位特異的変異

研究概要

本課題では、金属エキソペプチダーゼであるアエロモナスアミノペプチダーゼにおいてプロテインメモリー現象を引き起こす分子内シャペロンの特性を解析するとともに、分子内シャペロンの変異によって生じる成熟体部分の立体構造の変化を原子レベルで解明することが目的である。本年度は下記1〜3の研究結果が得られ、当初の研究実施計画を達成した。
1、アエロモナスアミノペプチダーゼと同じファミリーに属し、約60%のアミノ酸配列の相同性を持つビブリオアミノペプチダーゼを用いて分子内シャペロン部位を交換したキメラ酵素を作成し、大腸菌においてこれらを発現させた。その結果、活性酵素を得ることに成功した。
2、アエロモナスおよびビブリオアミノペプチダーゼのN末端プロペプチドにおいて保存されているアミノ酸残基のうち、Trp24、Ile25、His71、Glu72、Arg76、Cys77を、それぞれAlaに変異させた6種類のアエロモナスアミノペプチダーゼ変異体を作製し、その性質を調べた。Arg76、Cys77変異体は野生型と同様にプロセシングプロテアーゼにより成熟化したが、Trp24、Ile25、His71、Glu72変異体はプロセシングプロテアーゼにより成熟領域も加水分解された。以上の結果から、Trp24、Ile25、His71、Glu72変異体の立体構造の折り畳みは野生型のそれと異なることが推測された。
3、キラメ酵素について結晶化条件を検討し、結晶を得ることに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Nirasawa, S., Hayashi, K.: "Role of the N-terminal propeptide of bacterial zinc aminopeptidase in folding and stability"Protein science. 12. 78 (2003)
• [文献書誌] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Marie-Claire, C., Hayashi, K.: "General function N-terminal propeptide on assisting Protein folding and inhibiting catalytic activity based on observations with a chimeric thermolysin-like protease"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 301・4. 1093-1098 (2003)
• [文献書誌] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing Protease : refolding, processing, and enzyme inhibition"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 296・1. 78-84 (2002)
• [文献書誌] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "In vitro stepwise autoprocessing of the proform of proaminopeptidase processing Protease from Aeromonas caviae T-64"Biochim.Biophys. Acta. 1596・1. 16-27 (2002)
• [文献書誌] Majibuf, R.M., Bhuiyan, S.H, Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "Characterization of an endo-beta-1, 4-glucanase of Thermotoga maritima expressed in Escherichia coli"Journal of Applied Glycoscience. 49・4. 487-495 (2002)