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本年度はL型カルシウムチャネル関連分子であるJun activation domain binding protein(JAB)の機能解析を試みた。昨年行ったRT-PCR法による検討により、JABは、心筋以外の組織にも比較的発現が多く、ubiquitousな分子と考えられ、再構成系で使用するCos7細胞にも多く発現していることが明かになった。よって、Cos7細胞に発現している内因性のJABをsiRNAを用いてノックダウンして、カルシウム電流への作用の解析をしようとした。JABのN末のシークエンス情報をもとに、siRNAを2箇所で設定した。
まずコントロール実験として、siRNAでJABの発現が本当に抑制されているかを確認するため、siRNAの作成のために設定した、2箇所の配列の両方をはさむようにプライマーを設定し、Cos7細胞から抽出したmRNAに対してoligodTプライマーでRTを施行し、設定した2つのプライマーでPCRを施行した。その結果、コントロールのsiRNAをトランスフェクションした細胞では、PCRサイクル25回で遺伝子の増幅が認められたのに対して、JABを標的としたsiRNAを発現させた細胞では、2種類ともPCRサイクル35回施行しても遺伝子の増幅を認められなかった。これによりsiRNAにより、JABの発現が抑制されていることが明かになったので、これを利用してカルシウム電流への影響を解析したが、今研究期間中において明確な結果を得ることは出来なかった。今後、Myc tagで標識したJABを作成し、抗Myc抗体を用いて、免疫沈降法で再構成系の細胞のなかでJABとL型カルシウムチャネルのα1cサブユニットが実際に結合しているか確認する実験を行いたいと考えている。
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