遺伝子ターゲティングによる糖尿病血管合併症の原因・治療の解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14770058
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 山本 靖彦 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (20313637)
• キーワード: 糖尿病 / 合併症 / 血管障害 / 後期糖化反応生成物(AGE) / レセプター / RAGE / ノックアウトマウス

研究概要

山本らは、糖尿病状態で促進的に形成される後期糖化反応生成物(advanced glycation endproducts、以下AGE)が、AGE特異受容体(receptor for AGE、以下RAGE)を介して、糖尿病に特徴的な血管細胞変化を来すことを見い出した。また、RAGEを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して糖尿病を誘発すると、腎症の発症・進展が加速されることを証明した(J. Clin. Invest.2001)。したがって、AGE-RAGE系は糖尿病血管合併症克服のための分子標的候補と考えられ、RAGE遺伝子の制御によって糖尿病血管合併症は抑制可能と考えられた。
本研究では、将来的にRAGEをターゲットとした遺伝子治療を目指し、糖尿病血管合併症の新しい予防・治療原理を導くことを目的とする。本年度はRAGE欠損マウスの作製と解析を中心に行い以下の結果を得た。
1.マウスRAGE遺伝子の翻訳開始コドンを含むエキソン1および2を挟むようにloxPエレメントを挿入したターゲティングベクターを作製後、マウスES細胞にエレクトロポレーションすることで、相同組み換え変異体が導入されたES細胞株を選択分離した。
2.得られたES細胞をマウス8細胞期胚と凝集させ偽妊娠マウスの子宮に戻すことでキメラマウスを計23匹作製した。それらのマウスからES細胞由来の次世代が得られる生殖系列伝播を確認の後、卵細胞でCre recombinase蛋白が一過性に発現するCreトランスジェニックマウスと掛け合わせRAGE遺伝子が全身で欠損したマウス(全身型;コンベンショナルタイプ)およびRAGE欠損が時期・組織選択可能なマウス(コンディショナルタイプ)系統を樹立した。選択的血管細胞型RAGE遺伝子欠損マウスについては、血管内皮細胞特異的にCre recombinase蛋白を発現するTie2-Creトランスジェニックマウスと交配中である。
3.2で得られた全身型RAGE遺伝子欠損ヘテロマウス同士を掛け合わせることによって全身型RAGE遺伝子欠損ホモマウスを作出した。そのマウスから臓器・組織を摘出し、RT-PCR法、ウエスタン法によりRAGEの欠損を確認した。
4.全身型RAGE遺伝子欠損ホモマウスは見かけ上正常に発生・成長し、肉眼的・組織学的には主要臓器に形態異常を認めなかった。

研究成果

• [文献書誌] Yonekura, H: "Novel splice variants of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) expressed in human vascular endothelial cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced vascular injury"Biochem.J. 370. 1097-1109 (2003)
• [文献書誌] Miura, J.: "AGE downregulation of monocyte expression of RAGE mRNA and its association with diabetic complications in type 1 diabetes"J. Diabetes Complication. (In press). (2003)
• [文献書誌] Sakurai, S.: "The AGE-RAGE system and diabetic nephropathy"J.Am.Soc.Nephrol.. (In press). (2003)
• [文献書誌] Petrova, R.: "Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes"J.Mol.Cell.Cardiol.. 34. 1425-1431 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, Y.: "The role of AGE-RAGE system in the development of diabetic nephropathy in vivo"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 45-50 (2002)
• [文献書誌] Yonekura, H.: "RAGE engagement and vascular cell derangement by short chain sugar-derived advanced glycation endproducts"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 129-135 (2002)
• [文献書誌] Sakurai, S.: "Identification of a novel AGE-capturable soluble variant of the RAGE in human sera"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 163-167 (2002)
• [文献書誌] 山本 靖彦: "糖尿病学2002「RAGE トランスジェニック糖尿病マウスにおける糖尿病腎症」"診断と治療社. 4 (2002)
• [文献書誌] 渡辺 琢夫: "Diabetes Frontier「高血糖による細胞内酸化ストレス増強機序 1.終末糖化産物」"メディカルレビュー社. 5 (2002)
• [文献書誌] 大澤 真理: "Annual Review腎臓「新しい糖尿病腎症モデル」"中外医学社. 5 (2003)
• [文献書誌] 山本 靖彦: "日本薬理学雑誌「AGE-RAGE系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」"日本薬理学会. 8 (2003)