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マウスサイトメガロウイルス(MCMV)前初期(IE)遺伝子を標的としたリボザイムの作成:マウスCMV(MCMV)のIE遺伝子のうちIE1とIE3に共通なmRNAに対するハンマーヘッド型リボザイムを数種類設計し、in vitro cleavageにて切断活性を確認した。
MCMV IE mRNAを標的としたリボザイムの培養細胞への導入と発現:in vitro cleavageの結果より、切断活性の高いリボザイムをtRNAプロモーターとpuromycin耐性遺伝子もつplasmidベクターに挿入した。このリボザイム発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、puro-mycin耐性クローンを作製し、リボザイム発現クローンをRT-PCRで確認した。
リボザイム発現細胞におけるMCMV IE遺伝子産物の発現抑制と感染抑制の確認:リボザイム高発現細胞および対照NIH3T3にMCMVを感染させた。MCMV IE遺伝子産物の発現をIE1特異抗体(N2)を用いたフローサイトメトリーで経時的な解析を施行したところ、リボザイム高発現細胞では対照MIH3T3と比較して10倍程度のIE発現抑制効果を確認した。また、培養上清および細胞ホモジネートでマウス胎児線維芽細胞を用いたプラークアッセイによるウイルス増殖抑制効果を現在検討中である。
MCMV潜伏感染モデルにおけるウイルス増殖抑制の試み:F9細胞(teratocarcinoma cell line)にリボザイム発現ベクターを導入しリボザイム発現クローンを作成した。GFP発現MCMV感染後72時間のリボザイム発現クローンと対照F9をレチノイン酸により分化誘導したところ2週間後のGFP発現に著明な差がみられた。現在その増殖抑制効果をプラークアッセイとN2を用いたフローサイトメトリーにより検討中である。
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