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1 ラット新生児培養心筋細胞を用いたcardiosphere形成と心筋幹細胞・前駆細胞の単離
(1)生後一週齢のラット新生児の心臓を無菌的に単離後、既知の手法により線維芽細胞と心筋細胞を分離する。更にパーコール法を用いて心筋細胞を純化の後、FGF2およびEGFを添加した無血清培養液にて培養を行う。
(2)数日に一回、培養液を半量ずつ交換し、数週間培養を続けると大部分の細胞が死滅するが、ごく一部の細胞が増殖し球体を形成、拍動を時に認めるようになる。この細胞塊をトリプシン等で単離するし、同様に無血清培養液で培養すると、再び一部の細胞が増殖し、球体を形成する。
(3)同細胞群がα-actin、ミオシン軽鎖-2v等の心筋特異的な蛋白を発現することが確認された。またそのほかにも神経幹細胞特異的マーカーの発現も確認している。
2 Cardiosphere形成細胞の生体での機能
(1)Cardiosphere細胞をトリプシン等で単離し、DiIという蛍光色素にて膜を標識したのちに、成体マウスに経静脈的に30-100万個移植する。実際には経尾静脈もしくは経眼窩静脈叢経由にて細胞投与を行った。ラット・マウスと異種間の細胞移植であるが、免疫抑制剤等は使用せず、無投薬で経過観察し、すべてのマウスで特に異常を認めなかった。
(2)三日後に細胞投与マウスを全身麻酔の後に屠殺し、全身の臓器での投与細胞の同定を行った。
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