| 研究概要 |
昨年度までにOligo-capping法によるmRNA transcription start siteの推定と、その上流領域DNAをluciferase発現Vector(pGL3 Basic, Promega)に組み込み、培養細胞にtransfectionすることによりHuman Extracellular Superoxide Dismutase(EC-SOD)のpromoter領域を特定することが出来た。今年度はその結果を基に細胞特性発現の検討及びpromotor活性の調節領域の検索について検討行った。
前者に関してはEC-SOD発現の細胞特異性をプロモーター領域のメチル化によって説明可能であるか否かを検討した。EC-SODを発現していないHepG2、血管内皮細胞、HEK293細胞に脱メチル化剤(5-aza-2-deoxycytidine)存在下で培養を行った。しかしながら種々の条件下で検討を行ったものの、EC-SOD蛋白の発現は認められなかった。又同時にBisulfite sequence法を用いてEC-SOD promoter領域におけるCpG配列のメチル化についても検討したが、これについても一定の傾向は確認できなかった。
後者に関しては特定したPromoter領域にCREB、AP-1結合配列が認められたことよりまずcyclic AMP及びPMAで刺激を行いpromoter活性が上昇する否か検討した。Cyclic AMP刺激では濃度及び細胞種を変えた検討においても有意な所見は認めなかったが、PMA刺激では50nM存在下でpromoter活性の上昇を認めた。さらにAP-1発現Vectorとのco-transfectionによってもEC-S0D promoter活性の上昇を認めた。用いた約300bpのEC-SOD promoter領域DNAには推定されるAP-1結合配列が3箇所認められており、どの領域が強く関与しているのかをDNA mutation及びgel shift assayを用いて検討する予定としている。
又mRNA transcription start siteより200Obp上流までのDNA領域をpGL3,Basic Vectorに組み込む事が出来、同領域には種々の転写因子結合配列があることより、今後は報告のあるEC-SOD発現を亢進させる条件としてIFN-γ、c-GMP、Defferoxamineを用いて検討を行う予定である。
|
