| 研究概要 |
1 CRFレセプター遺伝子プロモーターの単離に関して。
(1) ヒト下垂体ACTH産生腺腫細胞より、totalRNAを抽出しOligo-capping法を用いてCRFレセプター遺伝子の転写開始点(以下TSS)を決定した。優位なそれは、第一メチオニンをコードするATGより、-225baseの部位と考えられた。同部位より上流を腺腫細胞由来cDNAを鋳型とし、PCRの後、CRF受容体遺伝子プロモーター領域の塩基配列解析を行った。同領域は、典型的なTATAボックスやイニシエーター配列は、存在しなかった。また、CRFの細胞内シグナルは、cAMP-protein kinaseA系であるが、cAMP responsive elementも存在していなかった。一方、TSSより-1252base内だけでも、AP-1,-2 siteを計21箇所認め、FOS, JUNなどのimmediate early geneの遺伝子発現への関与が示唆された。また、既報のゲノム配列と比較して、現時点で新たな多型配列は、確認していない。
(2)現在同プロモーター領域にLacZcDNAを繋いだプラスミドを用いて、transgenic mouseの作製中である。
2 下垂体ACTH産生腺腫細胞における、CRFによるCRF受容体遺伝子発現活性化機構の解明
前述塩基配列解析に用いたPCR産物(6kb)を用いて、下流にルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つコンストラクトを作製し、AtT20細胞に、transient transfectionし、基礎プロモーター活性を確認した後、CRF10nM添加した処、その活性は、数倍に上昇した。現在再検中である。また、一方、dose-response, time courseの仕事も検討中である。
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