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1)HIF1αの発現抑制に対してsiRNA発現vectorを用いていたが、その改良を行った。以前のsiRNA発現形態はtandem型と呼ばれるものであったが、より効果を増強させるためにstem loop型と呼ばれる発現形態のものに変更した。その際に再度HIF1αに対するtarget配列の検討と効果に影響を与えるとされるloop配列についての検討も行い、以前のものより効果的な抑制効果を有するvectorを作製した。効果の確認はnorthern blotting、western blottingにて行った。
2)HIF1αに対するsiRNA発現vectorの効果を膵癌細胞株M1A Paca2、PK-8、PANC-1、胆管癌細胞株TFK-1、HuCCT1、肝癌細胞株HepG2において検討した。通常状態、低酸素状態の両方でcolony formation assayを施行したが、HepG2以外の細胞株に関しては低酸素下だけでなく、通常状態でもある程度の増殖抑制効果が認められた。
3)HIF1αの抑制による増殖抑制効果を検討するため、HIF1αにより転写の制御を受けているVEGF、Glut1、Aldorase Aの詳細な検討と、flow cytometry、Hoechst染色による細胞周期、アポトーシスの検討を行った。結果、糖代謝に関与するGlut1、Aldorase Aが、特に低酸素下でHIF1αを抑制することにより著明に抑制されていることが確認できた。また増殖抑制には細胞周期はあまり関与しておらず、アポトーシスの増強によりもたらされていることを確認した。
4)In vivoにおけるsiRNAの効果を検討するために、EBNA-1/OriPシステムを用いてsiRNAを恒常的に発現するtransformantを作製した。これをヌードマウスの皮下に移植してコントロール群と比較した結果、著明な増殖抑制効果を認めた。
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