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本申請の目的は、インプラント体が歯周組織に定着する期間の短縮化のために、インプラント法に応用できる人工的な細胞接着性タンパク質の開発を試みることである。初年度はまず、細胞の接着効果を評価するための実験条件を検討した。細胞は骨芽細胞様株化細胞として各種研究に多用されているマウス由来のMC3T3-E1を用い、10%血清を含むα-MEM培地にて培養した。代表的な細胞接着性タンパク質であるFibronectinの溶液を細胞培養用24穴プレートに500μlずつ分注し、4℃で一晩静置してコーティングした。未反応のタンパク質を洗浄し除去した後、新しい無血清培地に懸濁したMC3T3-E1細胞を播種し、37℃のCO_2インキュベーター内で温置し細胞を接着させた。PBSで洗浄しウェルに接着していない細胞を除去した後、細胞の形態を位相差顕微鏡にて観察し、顕微鏡に接続したカメラにて撮影した。さらに、ウェルに接着した細胞はトリプシンを作用させて回収し、セルカウンターで細胞数を計測した。
一方、人工細胞接着性タンパク質の作成を試みた。人工細胞接着性タンパク質を臨床に応用するためには有害な副作用がないことが必須条件となるため、動・植物の細胞や体液中に一般的に含まれる可溶性タンパク質であるアルブミンをキャリアータンパク質とした。氷冷下でリン酸緩衝液(PBS)に溶解したヒトアルブミンに、架橋剤として水溶性カルボジイミドを添加しカルボキシル基を活性化させた後、細胞接着性タンパク質の活性部位に共通するArg-Gly-Asp(RGD)アミノ酸配列を含む合成ペプチドを加え、4℃で24時間撹拌してRGD-アルブミン結合体を作製した。反応液はPBSにて透析を行い、未反応物を除去した。今後、Fibronectinの実験で得られた結果をもとに、RGD-アルブミン結合体の細胞接着効果に検討を加える。
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