| 研究概要 |
5α-レダクターゼは代表的なアンドロゲンであるテストステロン(T)を活性な5α-ジヒドロテストステロン(DHT)に還元する酵素であるが,前立腺癌や前立腺肥大症などのアンドロゲン依存性疾患によって,その発現量や活性が変化することが知られており,有用な5α-レダクターゼ阻害剤の開発が進められている.その評価には5α-レダクターゼ活性の測定が必須であるが,従来のそれは放射性同位体標識基質を用いる方法によるものが主で,それに伴う多くの問題を有している.そこでLC/APCI-MSによる5α-レダクターゼ活性測定法の開発を企て,以下の結果を得た.
1.基質(T),生成物であるDHT及び5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(3α,5α-diol)に加え,これらの5位又は3位異性体のクロマトグラフ的挙動を精査したところ,従来のカラムより高速分離可能なモノリス型カラムが有用であった.
2.Tをラット前立腺より得た酵素源,NADPHと共に緩衝液中インキュベートし,反応停止後固相抽出により精製後,LC/APCI-MSに付したところ,生成物としてDHT及び3α,5α-diolに対応するピークのみ検出された.これらの前処理操作による回収率は約80%で,5-40ng/tubeでの定量が可能であった.
3.本法を用いてラット前立腺中5α-レダクターゼ活性を測定したところ,K_m=0.91±0.3μM, V_<max>=13.0±3.5nmol/min/mg protein,また代表的な5α-レダクターゼ阻害剤であるフィナステライドの阻害活性を測定したところIC_<50>=237nMであり,いずれも報告値と符合するものであった.
以上,開発した5α-レダクターゼ活性測定法は放射性同位体標識体を用いず,定量性にも優れており,5α-レダクターゼ阻害剤の開発に有用であると期待される.
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