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ユビキチン非依存性プロテオリシスを誘導することで知られるアンチザイムは、歴史的にその標的としてオルニシンカルボキシラーゼ(以下ODCと略す)のみが知られ、分解誘導メカニズムが研究されてきた。しかしながらごく近年我々の研究も含め、アンチザイムをメディエーターとしたユビキチン非依存性プロテオリシスがODC分解以外にも広範な細胞機能制御に関わる可能性を示唆するデータが報告されている。そこで私はアンチザイムの新しいターゲットを探索することを目的とし、アンチザイムをベイトとしてYeast two-hybrid screenを行っている。報告者はまず、マウスアンチザイム(Oaz1)のコーディング領域全長685bpをPCRクローニングにより単離することに成功した。そして23kDを産生する2番目のATGからのアンチザイム全長および、C末110アミノ酸をコードする配列をbaitとしてpLexAベクターおよびp8op-lacZベクターに組み込み、EGY48酵母株に形質転換した。まず、組み込んだベイトタンパクが酵母において発現していることをLexAモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングにより確認した。その後種々の濃度の3ATを含有したSDプレートにベイトを形質転換した酵母を蒔き、酵母の生育しない至適3AT濃度を同定した。実際のスクリーニングには、pB42ADベクターに組み込んだP0からP4ステージのマウスcDNAライブラリーを使用した。現在出現したポジティブクローンについて、2次スクリーニングおよびβ-ガラクトシダーゼアッセイにより確認している。
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