| 研究課題/領域番号 |
14F04415
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
岩崎 俊雄 日本医科大学, 医学部, 講師 (40277497)
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| 研究分担者 |
TAGUCHI Alexander 日本医科大学, 医学部, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| キーワード | 機能、生理学 / 構造生物学 / 細菌 / 外国人特別研究員 |
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| 研究実績の概要 |
MitoNEETファミリーは II型 糖尿病改善薬 ピオグリタゾン（アクトス）の新規標的酵素であり、病原性細菌からヒトに至るまで高度に保存されている。これまでの研究で、mitoNEETの好熱菌ホモログTthNEETの結晶構造に基づいて鉄硫黄クラスター近傍のアミノ酸残基を改変、クラスター酸化還元電位の異なる変異酵素数種を作成した。本年度は年度途中からの採用になったが、これまで下記の研究を遂行した。
(1) 酸化還元電位が端的に低下したTthNEET H52C変異酵素、および酸化還元電位が上昇した変異酵素K53Eの構造精密化を行った。また、新規Met要求性大腸菌発現宿主株を用いてSe-Met標識導入K53Eを精製・結晶化し、その構造精密化もほぼ完了した。
(2) His-tagつきTthNEETをNi-NTAカラムに固定し、TthNEETアフィニティーカラムを作成した。これにTthNEET完全欠損株の菌体抽出液と反応させ、TthNEETと強く結合する候補蛋白質を電気泳動にて分離、質量分析で幾つか同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TthNEET変異酵素の構造精密化技術を取得し、当初計画通りすすめることができた。また、プルダウンアッセイおよび質量分析により、幾つかTthNEET結合候補蛋白質を絞り込むことに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
プルダウンアッセイで絞り込んだ候補蛋白質を大量発現させ、TthNEETとの相互作用解析および可能ならば共結晶作成を試みる。また、二次元電気泳動と質量分析を用いたプロテオーム解析をすすめ、TthNEET蛋白質の有無による蛋白質プロファイルの違いを詳細に検討する計画である。予備実験を行ったが、熱安定な好熱菌蛋白質を材料としているためか、一次元目泳動の分離が非常に悪く、再現性にも問題がある。今後はその改善をすすめ、網羅的解析を遂行する計画である。
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| 備考 |
参考論文２報：Taguchi, A T et al. (2015) Hydrogen Bond Network around the Semiquinone of the Secondary Quinone Acceptor QB in Bacterial Photosynthetic Reaction Centers. J. Phys. Chem. B, 119, 5805-5814 他１報.
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