ｉＰＳ細胞由来の造血幹細胞を利用した再生不良性貧血自己抗原の同定

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14F04419
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 中尾 眞二 金沢大学, 医学系, 教授 (70217660)
• 研究分担者: ESPINOZA CALDERON Jorge Luis 金沢大学, 医学系, 外国人特別研究員
• 研究期間 (年度): 2014-04-25 – 2017-03-31
• キーワード: 再生不良性貧血 / 6pUPD / iPS細胞 / 造血幹細胞 / 細胞傷害性T細胞

研究実績の概要

再生不良性貧血を引き起こす細胞傷害性T細胞（CTL）の単離を目的として、その標的細胞である自己造血幹細胞を潤沢に得るために、第6染色体短腕のuniparental disomy（6pUPD）を有する再生不良性貧血患者4例の単球およびB lymphoblastoid cell line (LCL)2株からiPS細胞の誘導を試みた。その結果、末梢血単球を用いた2例とLCLを用いた1例からiPS細胞が樹立された。このうち6pUPDのためHLA-A24が欠失しA2 のみを発現している単球が50％を占める1症例由来のiPS細胞6クローンを対象としてHLA-A発現を検討した。その結果、SSEA-4陽性の未分化なiPS細胞ではHLA-Aの発現が見られなかったのに対し、培養中にSSEA-4発現を失った分化傾向のあるiPS細胞では、弱いながらHLA-A発現が確認された。しかし、発現レベルが弱いため、親細胞のように明らかにA24を欠失している細胞を同定することは困難であった。このため、HLA-B、Cアレル量を定量する定量的PCR法を開発し、これを用いて、単球のほぼ100％が6pUPDを占める別の1例から樹立したiPS細胞8クローンを検討したところ、すべてのクローンが6pUPDクローンであった。CTLを誘導するためには、その標的細胞として6pUPD陽性iPS細胞と6pUPD陰性（正常）iPS細胞の両者が必要であるため、現在他の症例のiPS細胞についても定量的PCR法によるスクリーニングを行っている。また、既に樹立されたiPS細胞を用いてin vitro培養による造血幹細胞の誘導を試みている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

6pUPDを有する再生不良性貧血患者の単球から予定通りiPS細胞が樹立された。また、6pUPD陽性細胞がほぼ100%を占める患者単球から、6pUPDのためloss of heterozygosityを起こしたiPS細胞が樹立された。この研究の過程で、①iPS細胞はHLAクラスIをほとんど発現していないため、抗体による6pUPD細胞の同定が困難であること、②われわれが開発したHLAクラスIアレル特異的定量的PCRが6pUPD陽性細胞の同定に非常に有用であること、が明らかになった。
一方、6pUPD陽性単球と陰性単球の両者を均等に有する患者は少数であるため、一人の患者から6pUPD陽性iPS細胞、6pUPD陰性iPS細胞の両者を樹立するには至っていない。

今後の研究の推進方策

造血幹細胞上の特定のHLAクラスI分子によって提示される自己抗原を同定するためには、一人の患者から6pUPD陽性・陰性のそれぞれのiPS細胞細胞を樹立し、各々から誘導した造血幹細胞を標的として、患者自身の細胞傷害性T細胞による殺細胞性を比較する必要がある。これまでの検討により、患者単球から6pUPD陽性のiPS細胞を樹立できることが明らかになった。今後は、一人の患者から6pUPD陽性iPS細胞・6piPS細胞陰性の両者を樹立し、それぞれから造血幹細胞の誘導を試みる。iPS細胞からの造血幹細胞の誘導については、当初予定した免疫不全マウスでの奇形腫作製に加えて、in vitroでの造血幹細胞誘導を検討しており、一部では造血前駆細胞の誘導に成功している。

研究成果

• [雑誌論文] Somatic mutations and clonal hematopoiesis in aplastic anemia. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshizato T, Dumitriu B, Hosokawa K, Makishima H, Yoshida K, Townsley D, Sato-Otsubo A, Sato Y, Liu D, Suzuki H, Wu C, Shiraishi Y, Clemente MJ, Kataoka K, Shiozawa Y, Okuno Y, Chiba K, Tanaka H, Nagata Y, Katagiri T, Kon A, Sanada M, Scheinberg P, Miyano S, Maciejewski JP, Nakao S, Young NS, Ogawa S.
  • 雑誌名: N Eng J Med 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of HLA-B*40:02-restricted T cells possessing cytotoxic and suppressive functions against hematopoietic progenitor cells from a patient with severe aplastic anemia. (2015)
  • 著者名/発表者名: Inaguma Y, Akatsuka Y, Hosokawa K, Maruyama H, Okamoto A, Katagiri T, Shiraishi K, Murayama Y, Tsuzuki-Iba S, Mizutani Y, Nishii C, Yamamoto N, Demachi-Okamura A, Kuzushima K, Ogawa S, Emi N, Nakao S.
  • 雑誌名: Br J Haematol 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] Imatinib for bronchiolitis obliterans after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, Waseda Y, Kimura H, Takato H, Ohata K, Kondo Y, Kasahara K, Nakao S.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] Persistent molecular remission of refractory acute myeloid leukemia with inv(16)(p13.1q22) in an elderly patient induced by cytarabine ocfosfate hydrate. (2015)
  • 著者名/発表者名: Arahata M, Shimizu Y, Asakura H, Nakao S.
  • 雑誌名: J Hematol Oncol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1186/s13045-014-0100-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Paraptosis cell death induction by the thiamine analog benfotiamine in leukemia cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugimori N, Espinoza JL, Trung LQ, Takami A, Kondo Y, An DT, Sasaki M, Wakayama T, Nakao S.
  • 雑誌名: PloS One 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0120709
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased glycosylphosphatidylinositol-anchored protein-deficient granulocytes define a benign subset of bone marrow failures in patients with trisomy 8. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa K, Sugimori N, Katagiri T, Sasaki Y, Saito C, Seiki Y, Mochizuki K, Yamazaki H, Takami A, Nakao S.
  • 雑誌名: Eur J Haemat 巻: 18 ページ: -
  • DOI: 10.1111/ejh.12484
  • 査読あり
• [雑誌論文] Relative incidences and outcomes of Clostridium difficile infection following transplantation of unrelated cord blood, unrelated bone marrow, and related peripheral blood in adult patients: a single institute study. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa K, Takami A, Tsuji M, Araoka H, Ishiwata K, Takagi S, Yamamoto H, Asano-Mori Y, Matsuno N, Uchida N, Masuoka K, Wake A, Makino S, Yoneyama A, Nakao S, Taniguchi S.
  • 雑誌名: Transp Infectious Dis 巻: 16 ページ: 412-420
  • DOI: 10.1111/tid.12224
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful hyperbaric oxygen therapy for refractory BK virus-associated hemorrhagic cystitis after cord blood transplantation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa K, Yamazaki H, Nakamura T, Yoroidaka T, Imi T, Shima Y, Ohata K, Takamatsu H, Kotani T, Kondo Y, Takami A, Nakao S.
  • 雑誌名: Transp Infectious Dis 巻: 16 ページ: 843-846
  • DOI: 10.1111/tid.12266
  • 査読あり