2014 年度実績報告書

ＣＣＮ２個別モジュールの機能解明と変形性関節症治療薬開発に向けた橋渡し研究

研究課題

研究課題/領域番号	14F04420
研究機関	岡山大学
研究代表者	滝川正春岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063)
研究分担者	ABD EL KADER Tarek 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 外国人特別研究員
研究期間 (年度)	2014-04-25 – 2017-03-31
キーワード	CCN2/CTGF / モジュール / 軟骨細胞 / 変形性関節症 / 線維芽細胞 / 線維化 / 血管内皮細胞 / 血管新生
研究実績の概要	１）各個別モジュールの線維化促進作用の検討 CCN2の病理的作用として線維化促進作用が知られているがこの作用に関わるモジュールを特定するため、ヒト線維芽細胞培養系に全長CCN2、CCN2の４つの個別モジュールとそれら４つのモジュールをmixして、さらにTGF-betaをpositive controlとして添加し、I型コラーゲンと平滑筋actinを線維化のマーカーとしてそのmRNAレベルをRT-PCRで測定したところ、TSP1モジュールが全長CCN2とほぼ同程度の線維化促進効果（pr-ofibroblotic effect) を示すことがわかった。また、４つのモジュールをmixして添加した場合も全長CCN2の効果を再構成できた。一方、IGFBP, VWC, CTモジュールは効果がなかった。２）各個別モジュールの血管新生作用の検討活性モジュールに徐放性を与える実験は本実験の結果を得てからまとめて次年度にすることとし、当初次年度にお予定していた血管新生作用の実験を先行させた。その結果、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞培養系に、全長CCN2とCCN2の４つの個別モジュールおよびVEGFとFGF2添加し、その増殖と管腔形成に対する影響を調べたところ、IGFBPモジュールがFGF2と同様に増殖を促進するが管腔形成は引き起こさないこと、VWC、TSP1 およびCTモジュールはVEGFと同様に管腔形成促進作用があるというpreliminaryなデータが得られた。なお、本実験は購入したHUVECの状態に再三にわたりトラブルがあったこともあり、信頼あるデータするには再確認を必要がある。３）piggyBacトランスポゾンシステムにてHAタグ付きヒトCCN２（rCCN２HA）をドキシサイクリン誘導性に発現するベクターを構築した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由（１）の各個別モジュールの線維化促進作用の検討は順調に進んだ。（２）の活性モジュールに徐放性を与える実験は、血管新生作用の結果を踏まえて行うほうが効率的と考え後回しにして、次年度に予定していた血管新生の実験を前倒しして開始した。その結果、試行錯誤の末preliminaryな結果が得られた。また、piggyBacトランスポゾンシステムにてHAタグ付きヒトCCN２（rCCN２HA）をドキシサイクリン誘導性に発現するベクターを構築することも行った。そもそも、当該年度は７ヶ月しかないため、本年度の検討は予備的なものとなり、本格的な検討は次年度になる予定としていたことを考えると、おおむね順調に進んでいる。
今後の研究の推進方策	（１）前年度は７ヶ月しかなかったため、得られた結果は予想通りpreliminaryなものが多く、それらを順次確認していく。（２）血管新生については、in vitroの結果をもとにニワトリCAM assayやin vivoの実験も行う。（３）軟骨欠損修復実験、血管新生実験ともにin vivo実験では、ヘパリン結合性のドメインを活性モジュールに連結させ徐放性を付与したり、従来使用していたゼラチンハイドロゲルに代わる除法剤を援用するなど、in vivoで効果を発揮させるための方策を講じる。