| 研究課題/領域番号 |
14J00157
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
坪田 庄真 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 神経芽腫 / MYCN / Spheroid culture / エピゲノム / 網羅的解析 |
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| 研究実績の概要 |
有効な分子標的薬の開発が神経芽腫研究の大きな課題の一つであるが、主に末期腫瘍を対象にしたこれまでの研究が根本的な分子標的の同定に繋がらない理由の一つであると言える。
当研究では神経芽腫のマウスモデルであるMYCNトランスジェニック（MYCN-Tg）マウス、新しく確立した培養手法を用い、特に腫瘍形成の初期に着目し新たな分子標的の同定を目指している。
平成26年度までの研究成果として、全てのMYCN-Tgマウスの上腸間膜神経節（SMG、腫瘍発生部位）に存在する神経芽細胞（≒神経芽腫細胞）の運命が、腫瘍形成（80 %）と自然退縮（20 %）の二つに分かれるということが明らかになってきた。さらにMYCN遺伝子発現時期の特定に取り組み、発生段階である胎生期に既に腫瘍形成の初期イベントが起こっていることも明らかになってきた。一方、腫瘍形成／運命分岐に関わるメカニズムを解明するために網羅的解析に取り組もうとしたが、不均一なSMGから神経芽細胞のみを回収するのは技術的に困難であった。問題解決策として、これまで成功例のなかったSpheroid cultureに取り組み、in vitroで選択的にSMG由来神経芽細胞を培養することに成功した。特に初期段階と考えられる胎児期由来のSphereに着目し、ゲノム・エピゲノム解析を行った結果、大きなゲノム異常は見られなかったが、エピゲノム異常が既に起きていることを示唆するデータが得られた。今現在、データ解析中であるが、エピゲノム関連遺伝子群に着目して解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度の計画通り、2つの準備実験と解析作業に取り組んだ。
1つ目の準備実験である腫瘍発生の開始時期の特定については、in situ hybridizationや免疫染色を行いMYCNの発現を確認した。免疫染色は検出感度が低く、内在性マウスMycnと交差するということが分かり、検出は技術的に困難であった。in situ hybridizationでは、発生過程である胎児期中期において野生型には見られないシグナルをMYCN-Tgマウスで確認できたことからから、胎生中期が腫瘍開始の時期と判断した。
2つ目の準備実験である運命分岐の表現型については、当初の想定とは異なりin vivoで見られた運命分岐の表現型がin vitroの結果と異なっていた。この結果も踏まえて、まずは腫瘍形成の初期イベント特定を当面の目標として研究を遂行している。特に胎児期に着目しSpheroid cultureの実験を行ってきた結果、胎児期由来Sphereの形成に成功した。得られたSphereは皮下腫瘍形成能を示した。これらの結果からMYCN-Tgマウスでは、胎児期が腫瘍形成の初期であるだろうと考えた。得られたSphereを対象に網羅的解析を進めている。
解析作業については、幾つかのゲノム・エピゲノム解析を行った。アレイCGH解析の結果、ゲノムレベルでの異常は腫瘍発生の初期イベントではない可能性が高いということが明らかになった。mRNA遺伝子発現解析の結果、MYCN-Tgマウス由来のSphereではMYCNターゲット分子の発現レベルに変化（増加・減少）が見られ、DNA増幅や細胞増殖に関わる分子群の発現増加、及び分化に関わる分子群の発現減少が確認出来た。おそらくゲノム異常ではなく、エピゲノム異常が腫瘍形成の初期イベントとして重要ではないかと考え、現在エピゲノム解析を遂行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度中に完了しなかった解析を引き続き行いつつ、以下の実験を遂行し、特に腫瘍形成の初期イベントの解明と、それに関わる重要な責任遺伝子群の同定に試みる。
１、mRNA発現解析の結果から絞り込んだ幾つかの候補遺伝子（主に発現の違いにより得られた遺伝子）についてISHもしくは免疫染色を行い、MYCNの発現と照らし合わせながら、その発現パターン（時期、強度）を調べる。
２、in vitro spheroid culture系において、候補遺伝子をターゲットに遺伝子操作や阻害実験を行い機能亢進／阻害によるSphere形成への影響や皮下腫瘍形成能への影響を調べる。
３、in vitroでSphere形成等に重要であることが明らかになった遺伝子（群）については、in vivo実験を行う。得に初期段階において、薬剤や遺伝子操作により当該遺伝子の機能阻害が腫瘍形成にどのような影響を与えるか観察する。また同様の操作が野生型マウスに与える影響（副作用等）も同時に調べる。
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