| 研究課題/領域番号 |
14J00525
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
安本 周平 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 人工ヌクレアーゼ / TALEN / CRISPR/Cas / 植物ゲノム編集 / ゲノム育種 / 毛状根 |
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| 研究実績の概要 |
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術は新しい植物育種技術 (New Plant Breeding Techniques, NPBT) の一つであり、従来の突然変異導入を用いた育種では開発できない有用な作物を作出できることから、植物のゲノム育種への利用が期待されている。本研究では、人工ヌクレアーゼによる植物ゲノム育種を実用化に結びつけることを目的としている。
本年度は、初めに、簡便に人工ヌクレアーゼの活性を評価する系の構築を目指し、Agrobacterium rhizogenes を用いた毛状根培養系の構築を試みた。CRISPR/Cas 発現ベクターを A. rhizogenes に導入し、ジャガイモ・トマトへ感染させることにより毛状根を誘導し、ゲノムDNAの解析を行ったところ、短期間で標的遺伝子への変異導入が確認され、毛状根培養系が作製した人工ヌクレアーゼ発現ベクターを植物細胞内で迅速に評価するには有用であることが示唆された。
次に、形質転換作業を経ずに植物のゲノム編集を行うため、TALENタンパク質の植物細胞への導入を試みた。TALEN発現ベクターを大腸菌へ導入し、組換えTALENタンパク質を生産、ニッケルカラムによる簡易精製を行ったところ、in vivo において標的DNA切断活性を示すTALENタンパク質が得られ、プロトプラストへの導入法を検討してる。
また、シロイヌナズナゲノム上の近接した位置に存在する相同遺伝子について、TALENを用いて多重変異体を作出し、当該遺伝子機能の解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の計画通り、植物細胞を用いた人工ヌクレアーゼ発現ベクターの活性評価系を構築し、作製したCRISPR/Cas発現ベクターの活性評価を行った。成長の早い毛状根を用いることで、1-2ヶ月で人工ヌクレアーゼの植物細胞内での活性確認が可能となり、植物における人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集研究を効率的に進めることが可能となった。
また、外来DNAを用いない植物のゲノム編集は、最近韓国、アメリカの研究グループが独立して報告しており、技術的に可能であることが明らかとなったが、その編集効率は未だ低いため、改善の余地があると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製したTALENタンパク質を植物プロトプラストへ導入し、核酸導入を要しない植物ゲノム育種法の開発を進める。また、作出した変異体について、遺伝子機能の解析を進める。
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