| 研究課題/領域番号 |
14J01737
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
早瀬 晋 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 学習臨界期 / 発声学習 / ソングバード / 神経可塑性 / エピゲノム |
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| 研究実績の概要 |
発声学習における学習臨界期を制御する脳内神経メカニズムを調べることを目的とし、「発声経験依存的な脳内特定部位におけるエピゲノム制御が神経可塑性に関わる遺伝子群の発現を調節し、学習臨界期間の制御に影響を与える」とする仮説を立て、発達段階・発声経験の異なるソングバード脳を対象にトランスクリプトーム発現解析やエピゲノム解析などのゲノム生物学的研究を進めている。
これまでの研究で、ソングバード脳内の発声行動生成に特化した神経核RA、NIf内投射ニューロンにおいて、学習臨界期中限定的・発声行動依存的な発現誘導パターンを示す遺伝子群が見つかってきた。成鳥まで一切発声行動をさせない発声阻害個体の発声パターンおよび遺伝子発現を調べた結果、本来ならば発声パターンが固定化している日齢にもかかわらず、学習臨界期中のような音響特性変化に富んだ発声パターンを生成し、さらに成鳥では発現誘導率が低下しているはずの遺伝子群が神経核RA、NIfにおいて学習臨界期中と同程度に強く発現誘導されることが明らかになった。これらの結果は学習臨界期中の一日数千回にもおよぶ発声行動の積み重ねが、遺伝子群の発現誘導率変化、学習臨界期の終了に影響を与えている可能性を強く示唆する。現在これら神経可塑性に関わる遺伝子群と同じような挙動を示す遺伝子群を次世代シークエンスを用いたトランスクリプトーム解析で探索しており、その遺伝子近傍領域のエピゲノム制御に着目することで上記仮説の立証を目指している。その為には神経核RA内投射ニューロンに焦点を絞ったエピゲノム解析法が必須であり、現在1細胞レベルのレーザー・マイクロダイセクションと免疫沈降法、アダプターPCR法を組み合わせた方法を考案しサンプル調製を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
サンプリングまでに非常に時間と労力のかかる発声行動阻害実験個体群は計画通りにサンプリングに成功した。また次世代シークエンスを用いたトランスクリプトーム解析のサンプル調製を終え、シーケンスを開始できた点で当初の計画以上の進展があった。脳からの1細胞レベルの細胞キャプチャ、その後のエピゲノム解析に関しては手法確立の段階だが、チャレンジングな課題であり困難が予想されていたため、開始時期を早めたので全体の計画に大きな支障は無いと考えている。また神経活動を人為的に操作するためのDREADD(Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)システムを組み込んだアデノ随伴ウイルスベクター作成を完了、実際にソングバード脳内、神経核RA投射ニューロンにおけるウイルス感染・強制発現に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次世代シークエンスによるトランスクリプトーム解析の30サンプル分のシーケンスデータが本年度中に届くため、プラットフォーム上での解析および必要に応じて新たなアルゴリズム、プログラムの作成を進める。また、次世代シークエンス解析によって得られた候補遺伝子群の近傍領域のエピゲノム動態を神経核RA投射ニューロン内で調べるため、1細胞レベルのレーザー・マイクロダイセクションと免疫沈降法、アダプターPCR法を組み合わせた方法を確立する。これらの実験により、発声行動経験依存的な脳内特定細胞におけるエピゲノム制御と、発声学習臨界期制御の関係性を明らかにする。その後マイクロインフュージョンポンプを用い、得られたエピゲノム制御について阻害/促進する薬理実験を行い因果関係の解明を目指す。
候補遺伝子近傍のDNAメチル化状態に差異が無い、あるいは1細胞レベルでの実験手法の確立が不可能であった場合、ヒストン化学修飾をターゲットとした免疫沈降法に切り替え、実験を進める予定である。
実際に発声行動経験依存的なエピゲノム制御が実証された場合、発声行動回数、すなわち神経活動回数をカウントする分子メカニズムの存在が示唆される。そこでDREADDシステムを組み込んだ強制発現系を用いて人為的に神経活動回数を制御し、感染細胞特異的なエピゲノム動態変化を観察することで、細胞単位での神経発火カウント機構の解明を目指す予定である。
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