| 研究課題/領域番号 |
14J03643
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
端 昭彦 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 水環境 / 健康関連微生物 / 腸管系ウイルス / 感染力評価 |
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| 研究実績の概要 |
研究の背景
腸管系ウイルスは，中の未規制リスク因子であり，水の安全性・利用可能性を評価する上でその存在量の把握が重要である．腸管系ウイルス定量に広く用いられる定量RT-PCR (RT-qPCR) は，感染力を失ったウイルスも検出してしまう．一方で，宿主細胞によるウイルス検出法では，感染力を有したウイルスのみが検出されるが特異性が低い．両者を組み合わせたIntegrated Cell Culture (ICC)-PCRは通常の感染力を有したウイルスを特異的に検出できる．ここで得られる結果は定性的であるが，MPN法と組み合わせること (MPN-ICC-PCR) で定量的なデータとすることが期待できる．
研究の成果
水の汚染や水処理効率の観点から腸管系ウイルスの代替指標として期待されるFRNAファージについて，濃縮手法及びMPN-ICC-PCRによる定量タイピング手法の開発を試みた．従来のウイルス濃縮手法 (Katayama et al., 2002) は，一部のFRNAファージを不活化させてしまう．本研究では，FRNAファージを凝集させ，膜上に補足する手法を検討し，幅広い遺伝子型のFRNAファージを不活化させることなく，高効率 (98%以上) で回収できた．また，MPN-ICC-PCRによる定量タイピングも従来の検査手法 (プラック法) と同等程度の定量精度があることが確認できた．開発手法を下水，河川水，湖水試料に適用し，FRNAファージ遺伝子型の下水処理耐性や環境条件等による優占度合いの変化の評価を試みた．GI-FRNAファージは未処理下水中では比較的低濃度であるが，下水処理耐性が高く，下水処理水や放流先の水環境では比較的高濃度であることなどが明らかとなった．これらの他，アイチウイルス及びエンテロウイルスのMPN-ICC-PCRによる同時定量法も確立できた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は，1) MPN-ICC-PCRによるウイルス定量法の確立及び2) 下水試料からのウイルス検出を計画していた．本研究では，FRNAファージについて，従来のウイルス濃縮手法が有効でないことが確認されたため，新規濃縮手法の開発に取り組むと共に，FRNAファージ，アイチウイルス，エンテロウイルスについてMPN-ICC-PCRによるウイルス定量法を確立した．これらより，1) に関しては，概ね当初の予定通りに研究を進めることができた．また，本年度は下水試料のみならず，河川，湖水など幅広い水試料を収集し，分析に供することができた．さらに，FRNAファージについては従来手法及び新規のMPN-ICC-PCRによる定量を試みることで，定量的なジェノタイピングのみならず，遺伝子型ごとの特性やウイルス汚染及び下水処理効率指標に関する知見を得ることができた．したがって，2) に関しては当初の予定を越える進展があったと言える．以上を総括すると，本年度は当初の計画以上に研究を進展させることができたと評価できる．
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 下水試料からのウイルス検出: 本年度から継続して調査を行う．
(2) 河川水・湖水からのウイルス検出: 本年度から継続する．本年度行った内容に加え，従来のReal-time PCRによるウイルス定量も行う．新規手法であるICC-MPN-PCRと従来手法によるウイルス定量を比較することで，試料中のウイルスの不活化度合いや水環境中での流下，時間経過に伴う不活化進行度合いが評価可能になると期待される．また，水温，pH，電気伝導度 (イオン濃度)，酸化還元電位，有機物濃度，濁度等の一般水質項目も同時に計測することで，ウイルス不活化に影響する環境因子の解明を試みる．
(3) 自然水中での環境ストレスによるネズミノロウイルスの不活化評価: ヒトノロウイルスは疫学上特に重要なウイルス種であるが，現在，感染力を評価する有効な手法が存在しない．そこで，ヒトノロウイルスと近縁であり，かつ感染力評価が可能なネズミウイルスを用い，ヒトノロウイルスの感染力推定手法の確立を目指す．次年度は，収集した自然水試料にマウスノロウイルスを添加し，光照射条件や水温をコントロールした上で時間経過 (環境ストレス強度) に応じた不活化率を評価する．同時に，試料中に存在する他のウイルスについても不活化率を評価することで，環境ストレスに対するノロウイルスの感度を相対的に明らかにする．
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