研究課題
本研究の目的は、ラットを用い排卵中枢である前腹側室周囲核（AVPV）に局在するキスペプチンニューロンの活動を直接制御する新規神経伝達物質を明らかにすることである。キスペプチンによる性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) 分泌促進効果は様々な動物種で検証されてきたが、キスペプチンニューロンを制御するさらに上位の神経ネットワークは不明である。本研究は、キスペプチンニューロンの制御因子を明らかにできる点で学術的にも極めて重要で意義のある研究である。今年度は，「オスラット由来のフェロモンなどの化学物質によりAVPVキスペプチンニューロンが活性化し，黄体形成ホルモン (LH) の分泌が亢進するか検討すること」および「キスペプチンニューロンに発現するGタンパク共役型受容体 (GPCR) 遺伝子発現を解析し、キスペプチンニューロンをさらに上位で制御する求心性神経伝達物質あるいは神経ペプチドを同定すること」の2点について検討した。雌ラットに雄の床敷を曝露すると，雌ラットのAVPVのキスペプチンニューロンの発現増加，およびLHサージの増強が確認された。この結果から，雌ラットの嗅覚刺激によりAVPVキスペプチンニューロンの発現上昇を介し，LHサージが増強されることが明らかとなった。また，雄ラットにおいても，雌ラットとの交尾によりAVPVのキスペプチンニューロンが上昇し，一過性のLH分泌が起こることが明らかとなった。この他，排卵中枢キスペプチンニューロンに発現するキスペプチンニューロンに発現する2種類のGタンパク共役型受容体のノックアウトラットの作出，および経シナプストレーサーであるWGAを発現するトランスジェニックラットの作出も順調に進行している。本研究により，排卵中枢キスペプチンニューロンをさらに上位で制御するメカニズムの解明は，排卵障害の解明や予防法，治療法の開発への応用が期待される。
1: 当初の計画以上に進展している
当初の計画以上に進展している理由は主に、雄ラットから放出されるフェロモン等の化学物質によって雌ラットの排卵中枢のAVPVキスペプチンニューロンが刺激されLHサージが増強されることを明らかにした点，およびAVPVのキスペプチンニューロンに発現する2種類のGタンパク共役型受容体のノックアウトラットの作出，また経シナプスのトレーサーであるWGAを発現するトランスジェニックラットの作出が順調に進行している点である。ラットにおいて，オス由来の嗅覚刺激により雌ラットの排卵中枢のキスペプチンニューロンが活性化され，LHサージが増強されるという現象は，他に報告はなく貴重な知見を得ることができた。また，昨年度に当該研究室において明らかにした次世代シーケンサーによる結果を用いて，AVPVのキスペプチンニューロンに発現する遺伝子群から，リガンドが未知のオーファンGタンパク共役型受容体を2つ (以下，それぞれをGPCR-A，GPCR-Bと受容体の名称を伏せて表記する) を抽出し，CRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトラットの作出を目指している。GPCR-Aを標的とした実験群では17頭，GPCR-Bを標的とした実験群では1頭の産仔を得ることができた。現在，シーケンサーで配列を確認しており順調に進行している。また，経シナプスのトレーサーであるWGAを発現するトランスジェニックラットも，Kiss1CreERラットが2系統，CAG-floxed WGAラットも1系統得られ，順調に進行していると言える。本研究の応用に資する論文を仕上げて投稿し、学術誌への掲載が決定したため、本年度の研究進捗状況は当初の計画以上であると言える。
今後の研究推進方策は，昨年度の研究により明らかとなった雌ラットの嗅覚刺激により雌ラットのAVPVキスペプチンニューロンの発現上昇を介し，LHサージが増強されるメカニズムとこの現象を引き起こす雄ラット由来の物質の探索，およびトランスジェニックラットを作出し，キスペプチンニューロンを上位で制御するメカニズムを解明することである。具体的には，オス由来の嗅覚刺激により，雌ラットの鋤鼻器のどの領域の受容体が活性化しているかどうかをニューロンの活性化マーカーであるcFosタンパクの発現を指標に明らかにすることを目指す。合わせて，雄由来の物質が揮発性であるか，雄性ホルモン由来の物質であるか，物質の特性を明らかにする。また，排卵中枢キスペプチンニューロンに発現するキスペプチンニューロンに発現する2種類のGタンパク共役型受容体のノックアウトラットの作出，および経シナプスのトレーサーであるWGAを発現するトランスジェニックラットの作出も継続して行い，目的の表現型をもった動物を得られた後，すぐに解析をおこなう。解析に必要な抗体等の準備はすでにそろっているため，それぞれのトランスジェニックラットが生まれたときにはスムーズに解析にうつれる。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (3件)
Journal of Neuroendocrinology
巻: 27 ページ: 187-197
10.1111/jne.12257.
巻: 26 ページ: 909-917
10.1111/jne.12227.
Journal of Reproduction and Development
巻: 60 ページ: 312-316
