| 研究課題/領域番号 |
14J04949
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
熊谷 仁志 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 環境性決定 / オオミジンコ / doublesex / ゲノム編集 / Met / 2Aペプチド |
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| 研究実績の概要 |
性はどのように決まっているのか？ 古くから我々を魅了してやまないこの謎は、外部環境に応じて性を変化させる環境性決定生物において、モデル生物の不在のために未解決のまま残されていた。近年、オオミジンコが環境性決定のモデルとして確立しつつあり、オス産生は幼若ホルモンにより誘導される、doublesex1(Dsx1)遺伝子の発現がオス産生に必須であるということが明らかになった。ところが、幼若ホルモンとDsx1遺伝子をつなぐ分子機構は未だ不明である。そこで本研究は、環境性決定のモデル生物であるオオミジンコを対象に、Dsx1遺伝子の上流の発現制御を明らかにすることを目的とした。
研究にあたって、まず幼若ホルモンが結合する領域を調べた。幼若ホルモンは、Metと複合体を形成し、その後DNAに結合する。そこで、Hisタグを融合したMet遺伝子をゲノムに組み込んだ遺伝子組み換えミジンコを作製し、anti-Hisタグ抗体を使用したクロマチン免疫沈降法でMet-DNA複合体を回収しようと考えている。ミジンコへの遺伝子導入の可否を確認するためには、遺伝子導入時に同時に蛍光を発する遺伝子を入れておく必要がある。複数のプライマーを使用することでもその問題の解決は図れるが、その場合導入するプラスミドの配列長が長くなり、遺伝子導入が難しくなる。以上を踏まえた上で、2Aペプチドを用いた共発現システムを利用することが最良の選択だと考えられたが、ミジンコにおけるその機能は不明であった。そこで今年度は、ミジンコにおける2Aペプチドの機能を調べた。
まず、ミジンコの全身で機能するEF1a1プロモーターの制御下でGFP-2A-mCherryが発現するようなプラスミドを設計し、それをミジンコに導入した。その結果、蛍光顕微鏡により緑色と赤色の蛍光を確認することができた。これは、ミジンコにおいて2Aペプチドが機能していることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究の肝であった、ミジンコにおける２Aペプチドの機能を確認することができたので、本研究は当初の計画以上に進んでいると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
レポーター遺伝子とHisタグを融合したMet遺伝子を導入した“GFP-2A-HisMet”遺伝子組み換えミジンコを作製し、anti-His抗体を使用したクロマチン免疫沈降法を用いて幼若ホルモン応答配列を特定しようと考えている。
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