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2014 年度 実績報告書

結膜線維芽細胞から角膜内皮細胞へのdirect reprogramming

研究課題

研究課題/領域番号 14J04985
研究機関東京大学

研究代表者

中川 卓  東京大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2014-04-25 – 2016-03-31
キーワードダイレクトリプログラミング / 角膜内皮細胞 / 角膜上皮細胞
研究実績の概要

mRNA-sequencingとAffymetrix社のExon arrayを用いた網羅的遺伝子発現解析により、角膜内皮特異的な転写因子を38抽出し、このうち、培養皮膚線維芽細胞や培養角膜上皮細胞で高発現だったもの等を除き、角膜内皮特異的な転写因子として11転写因子を同定した。
これら11の転写因子のlentivirus vectorを、Invitrogen社のGatewayシステムを用いて作成した。Sanger sequenceにより、open reading frame全長がクローニングできたことを確認した。HEK293FT細胞を用いてウィルス粒子を作成し、10^5/ ml以上の力価が得られた。現在、結膜線維芽細胞と皮膚線維芽細胞に11転写因子を遺伝子導入し、角膜内皮細胞への分化誘導を試みている。

また、角膜上皮細胞について、同様の網羅的遺伝子発現解析とFAIRE(Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) -seqを用いたクロマチン構造解析により、角膜上皮細胞のkey転写因子を7つ同定した。内皮と同様に7転写因子のlentivirus vectorを、Invitrogen社のGatewayシステムを用いて作成した。Sanger sequenceにより、open reading frame全長がクローニングできたことを確認した。HEK293FT細胞を用いてウィルス粒子を作成し、10^5/ ml以上の力価が得られた。現在、表皮角化細胞・結膜上皮細胞に導入することにより、角膜上皮細胞への分化誘導を試みている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

角膜特異的転写因子のOpen reading frameの全長をレンチウィルスベクターにクローニングし、初代培養細胞への感染に必要な高力価のウィルス粒子を得ることができた。

今後の研究の推進方策

結膜線維芽細胞と皮膚線維芽細胞に11転写因子を遺伝子導入し、角膜内皮細胞への分化誘導を試みている。また、角膜上皮細胞について、表皮角化細胞・結膜上皮細胞に7転写因子を導入することにより、角膜上皮細胞への分化誘導を試みている。
さらに、初代培養細胞を用いた各転写因子のshによるknockdown細胞の網羅的発現解析や転写因子のChIP(chromatin immunoprecipitation)-seqによる各転写因子の下流遺伝子の同定により、角膜細胞の特異性維持の転写制御機構を網羅的に解明する。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Angiopoietin-like 7 is an anti-angiogenic protein required to prevent vascularization of the cornea.2015

    • 著者名/発表者名
      Toyono T, Usui T, Yokoo S, Taketani Y, Nakagawa S, Kuroda M, Yamagami S, Amano S
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: 10(1) ページ: 1-13

    • DOI

      10.1371

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Toxicity of Topical Antifungal Agents to Stratified Human Cultivated Corneal Epithelial Sheets.2014

    • 著者名/発表者名
      Kimakura M, Usui T, Yokoo S, Nakagawa S, Yamagami S, Amano S
    • 雑誌名

      J Ocul Pharmacol Ther

      巻: 30(10) ページ: 810-4

    • DOI

      10.1089

    • 査読あり
  • [学会発表] Landscape of transcriptional regulatory regions in human corneal epithelial cells2015

    • 著者名/発表者名
      Suguru Nakagawa, Ryo Nakaki, Genta Nagae, Seitaro Nomura, Motoaki Seki, Hiroyuki Aburatani
    • 学会等名
      CSHL 2015 Meeting, Systems Biology: Global Regulation of Gene Expression
    • 発表場所
      Rio Mar, Puerto Rico
    • 年月日
      2015-01-28 – 2015-02-01

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公開日: 2016-06-01  

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