研究課題
機能脂質であるスフィンゴ脂質の合成は、セリンパルミトイル転移酵素（SPT）によるL-セリンとパルミトイルCoA（Pal-CoA）の縮合反応から開始される。しかし、近年、SPTの変異によって基質特異性が変化し、L-アラニンやグリシンとPal-CoAの縮合産物である細胞毒性を持つ異常スフィンゴ脂質 (1-デオキシスフィンゴ脂質類: doxSL) 産生が誘発されることが報告された。しかし私は、SPTに変異がなくとも、アラニン/セリン比の上昇によるアミノ酸インバランスにより正常SPTによってdoxSLが合成されることを見いだした。今年度は我々がすでに確立していたdoxSL測定系の改良を行い、物質特異的なフラグメントを同定し、測定カラムやグラジエントを検討することで、より短時間で特異的な測定系を確立することができた。しかし、この新規フラグメントを用いた測定系は従来の脱水イオンモニター法よりも感度が下がることが明らかになった。また、これまでの研究でセリン合成酵素Phgdh KOマウス胎児由来の繊維芽細胞（KO-MEF）をL-セリン欠乏条件で培養すると、細胞内のdoxSL濃度が上昇することは明らかにしたが、その細胞内局在は不明だった。KO-MEFをL-セリン欠乏条件で培養すると細胞内に層状構造を持つ脂肪体を形成し、その脂肪体を超遠心によって分離して脂質解析を行ったところ、doxSLが蓄積していることが明らかになった。また、野生型のMEF（WT-MEF）、KO-MEFおよびHeLa細胞におけるdoxSA添加の影響を調べたところ、正常細胞やガン細胞などの細胞の種類によってdoxSLの毒性への抵抗性が異なることが明らかになった。
3: やや遅れている
セリンを前駆体として合成されたスフィンガニン（SA）は水酸基を1位と3位の炭素に2つ持つが、アラニンやグリシンを前駆体として合成される1-デオキシスフィンガニン（doxSA）や1-デオキシメチルスフィンガニン（doxmeSA）は3位または2位の炭素に付加した水酸基を1つしか持たない。近年、炭素の2位と3位の開裂から生じるフラグメントでセリン由来のSAはm/z 60、アラニン由来のdoxSAはm/z 44が報告され、スフィンゴイド塩基の1位の炭素に水酸基が付加しているかを判別できる新しい方法が提案された。そこで私は同じフラグメンテーションによってdoxmeSAから特異的なフラグメントが生じるか検討を行ったところ、doxmeSAからm/z 30のフラグメントが生じることを明らかにした。さらに、LCの測定カラムやグラジエントの条件を再検討して測定時間を10分短縮し、測定できる脂質の種類も追加して従来測定に用いていた系を改善した。さらに、KO-MEFをL-セリン欠乏条件で培養すると、細胞内に層状の構造を持つ脂肪体が観察された。その脂肪体をショ糖密度勾配遠心法によって分離して脂質分析を行ったところ、脂肪体にdoxSLが蓄積していることを明らかにした。また、野生型のMEF（WT-MEF）、KO-MEF、HeLa細胞にdoxSAを添加し、それぞれの細胞の生細胞数をカウントした。すると、WT-MEFとKO-MEFは溶媒のみの対照群に比べて1μM doxSAの添加で細胞増殖率が有意に低下するにも関わらず、HeLa細胞は1μMでは影響を受けず、5μMの濃度で増殖率が低下した。このことから、正常細胞やガン細胞などの細胞の種類によってdoxSLの毒性への抵抗性が異なることが明らかになった。
臓器や試料の種類により脂質の含有量が異なるため、測定に多くの量を必要とする試料もある。予備的検討において、肝臓サンプルでは従来の前処理法では夾雑物の残留が多く、測定を行うことが難しかった。そこで、前処理カラムや抽出溶媒等の検討を行い、全ての臓器試料に最適な前処理法を確立する。また、この新規フラグメントを用いた測定系は従来の脱水イオンモニター法よりも感度が下がることが明らかになったため、今後はあらゆるサンプルの測定に応用できるのか確認を行い、前処理などの検討によって感度上昇を図る。doxSLが細胞内の脂肪体に蓄積していることを明らかにしたが、その他のオルガネラにどの程度doxSLが存在するのかは不明である。スフィンゴ脂質合成酵素SPTは小胞体に豊富に存在することから、小胞体へのdoxSLの高濃度の蓄積が予想される。今後は小胞体だけでなくミトコンドリアや核なども分画してそれぞれのdoxSL濃度を比較し、分子型による局在の違いなども明らかにする。さらに、安定同位体標識アミノ酸を用いて安定同位体標識doxSLを細胞に産生させ、時間経過によるdoxSL代謝変化を検討する。また、現在、精神疾患患者由来iPS細胞におけるdoxSL産生を検討するために患者血液由来T細胞からのiPS細胞の樹立を進めている。今後、複数のラインを樹立した後に、正常対照群と精神疾患群のiPS細胞におけるdoxSLの関与について明らかにする予定である。
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