| 研究課題/領域番号 |
14J06037
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
設樂 久志 慶應義塾大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 線虫 / Ca2+イメージング / 行動 / cGMPイメージング / 感覚受容 |
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| 研究実績の概要 |
線虫行動と神経細胞感度の関係を明らかにするために、非拘束下で線虫行動とその際の神経細胞活動を測定することのできる顕微鏡装置が必要となる。本年度は、リアルタイムで線虫の画像を取得し装置にフィードバックを行うことで、常に線虫を観察下に置くためのプログラムを作成した。これを用いて感覚神経細胞AWCにCa2+インディケータであるGEM-GECOを発現させた線虫について、自由行動下における線虫の軌跡とAWCの活動を数分間にわたって同時に測定することに成功した。同時に、におい刺激を与える系も作製し、自由行動下でにおい刺激を与えた際のAWCでのCa2+応答も検出することができた。一方で、AWCのにおい感受感度を制御すると考えられるcGMPのイメージングにも着手した。cGMPの測定には当研究室で開発されたred cGES-DE5（Niino et al., 2009）と近年線虫系でcGMPイメージングの報告例があったcGi500（Couto et al., 2013）を使用した。この2つのインディケータはcGMPに対する親和性が異なるため、適切なものを選択しようと考えた。しかし、どちらのインディケータで測定を行っても、再現性のある結果は得られなかった。ただし、cGi500ではにおい刺激に対してcGMPが上昇する例と減少する例の2種類が見られた。同一神経細胞で異なるcGMP挙動を示す例は報告されており（Couto et al., 2013）、今回得られた結果がAWC樹状突起先端上でのcGMP挙動を表している可能性がある。
固定された状態ではない自由行動下での従来の神経活動測定は、行動のフィードバックが神経活動に及ぼす影響を調べる上で意義がある。こうした測定系に加えてにおい刺激を与える系を作製することで、感覚受容感度を明らかにすることができるのは重要である。また、他の神経細胞の様にAWCでcGMPが樹状突起先端で異なる挙動を示すということは、これまで知られていたAWCにおけるcGMPの役割とは異なる役割があることを示唆した点で意義がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の一つ目の目標である、非拘束下の線虫自由行動と神経活動を測定する顕微鏡を作製し、神経活動を数分間にわたって測定することに成功した。MATLBとArduinoを使用することによって、カメラから得られた画像を装置にフィードバックし、線虫を観察下に置くができたことから、当初の計画通りに観察系の作製を進めることができた。加えて、シリンジポンプと電磁バルブを使用し、パソコンで制御しながらにおい刺激を与える装置の作製にも成功した。実際にこの装置を用いて、自由行動下の線虫ににおい刺激を与えた際のCa2+応答を検出することができたことを踏まえると、顕微鏡装置の開発については計画以上の成果を得られた。
一方で、二つ目の目標であるcGMPのイメージングについて当初の計画は、におい刺激の種類や濃度、刺激時間のパラメータを振ってAWCでのcGMP応答を明らかにすることであった。しかし、におい刺激に対するcGMP応答の再現性が取れなかったため、刺激の種類や濃度を変化させたときのcGMP応答を評価までは至らなかった。しかし、におい刺激に対してcGMPが上昇する例と減少する例の2通りが存在する可能性を発見することができた。また、親和性の異なる2つのcGMPインディケータでイメージングを行うことでよりよいイメージング系の検証を行うことができた。そのため、当初計画していた様々なにおい刺激に対するcGMPの応答評価にまで至らなかったものの、cGMPのイメージングについてもある程度の進展は見られている。
以上を総合的に評価し、おおむね順調に進展していると評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
自由行動下における線虫の神経活動を測定することのできる観察系は完成したが、今後はこの系をさらに改良していく。現在までに作製した、パソコンで電磁バルブを制御しにおい刺激を与える系をさらに発展させ、線虫の行動や神経活動をフィードバックし、刺激を与えられる系の作製を試みる。また、測定系だけでなく取得したデータの解析プログラムの作成にも着手する。測定したデータより首振りの頻度や線虫が進む方向などを自動抽出するプログラムを作成し、解析を順次進める。
一方で、cGMP測定については再現性が取れるよう、さらなる系の改良と条件検討を行う。具体的にはさらに親和性が異なるcGMPインディケータを線虫に導入し、cGMP応答が検出されるか調べる。また、感覚受容感度の変化を調べる目的で異なる2つの神経細胞にインディケータを導入し神経活動を測定することを考えている。当初、cGMPを中心に測定し、感覚受容感度の変化を調べることを考えていたが、cGMPで測定することは困難になる可能性がある。そのため、場合によってはCa2+計測を中心とする方針に変更する。
加えて、感覚受容感度の変化を調べる上でそもそも感覚神経細胞AWCがどの程度のにおい刺激を正確にかぎ分けることができるかという疑問が生じてくる。行動によって感覚受容感度が変わることを正確に調べるために、におい濃度を振って刺激を与えることで線虫感覚神経細胞が感受できる濃度範囲を明らかにしようと考えている。
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