| 研究課題/領域番号 |
14J09354
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
白石 都 九州大学, 生物資源環境科学府, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | DNA修復 / Endonuclease Q / アーキア / PCNA |
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| 研究実績の概要 |
生物の遺伝情報を担うDNAは生体の代謝産物や外部からの刺激により絶えず損傷している。生物は遺伝情報の恒常性の維持のために、複数のDNA州復帰校を有していると考えられている。これまでの我々の研究においてDNA修復に関与すると考えられるEndonuclease Q (EndoQ)を超好熱性アーキアより発見した。
EndoQはその基質特異性やアミノ酸配列に着目しても、他に類似性のない新規のDNA修復酵素であったため、その修復経路についての解明につとめた。そこで、EndoQのアミノ酸配列に着目したところPCNAとの相互作用領域様の配列が存在した。PCNAはDNA代謝において広く活躍するタンパク質として知られている。相互作用解析を行ったところ、両者は特定の領域を介して相互作用するという知見が得られた。さらに、相互作用の生物学的意味を調べるために、PCNAのEndoQに対する活性への影響を調べたところ、PCNAはDNA上にのって、EndoQの活性を促進することが強く示唆された。以上の結果は今年、Nature Sci Rep誌の掲載を予定している。
さらに、本酵素は生物界の一部のアーキアとごく少数の真正細菌にのみ保存されている酵素であり、その運指針化についても興味深い。よって、比較解析を行うため常温菌アーキアMethanosarcina acetivorans由来のEndoQについての遺伝学的、生化学的解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
EndoQ が関与する損傷DNA修復経路を解明するために、他のタンパク質との相互作用解析を行った。対象としたタンパク質は超好熱性アーキア、Thermococcus kodakarensis由来のEndoQ (TkoEndoQ)とPCNA1 (TkoPCNA1)である。配列解析の結果、アーキア由来のEndoQ のC末端に、PCNAと相互作用するタンパク質が有するアミノ酸モチーフ（PIP box様モチーフ）があることが判明したため、相互作用解析を実施した。また、真正細菌由来のEndoQ ホモログにもPCNAの機能性ホモログである、β-クランプ分子との相互作用モチーフを見出した。相互作用解析は表面プラズモン解析により行った。解析の結果、TkoEndoQはTkoPCNA1と相互作用するという知見が得られた。さらに、相互作用の解析において、野生型と同様の手順で調整したPIP-box 欠損タンパク質（EndoQ ΔPIP）を用いると、相互作用が検出できなかったため、PIP-boxを介してTkoEndoQとTkoPCNA1は相互作用すると考えられる。さらに、相互作用の生物学的意味を探るために、TkoPCNA1のEndoQ活性に与える影響を調べた。EndoQはTkoPCNA1の濃度依存的に活性が促進された。この際、EndoQ ΔPIP、あるいは本来ホモ三量体であるTkoPCNA1の単量体変異体を用いるとEndoQ活性の促進は見られなかった。以上の結果から、EndoQはPCNAとPIP-boxを介する物理的相互作用によって、PCNAはEndoQの活性を促進するということが分かる。かつ、その促進活性において、PCNAは三量体を形成し、DNA上にローディングする必要があるということが明らかになった。これは、EndoQがDNA複製と連携した損傷DNA修復経路で働くことを示唆している。本成果はNature Scientific Report 誌に掲載予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
修復タンパク質の遺伝子はほとんどの生物において致死遺伝子ではなく、バックアップシステムの機構が示唆されている。よって、細胞内DNA損傷修復経路の役割分担について調べている最中である。常温性アーキアMethanothermobacter thermautotrophicus由来のExonuclease III (MthExoIII)がEndoQと一部同様の活性を示すことが報告されていたので、ExoIIIとEndoQの両方の配列が保存されている M. acetivoransにおいてExoIIIとEndoQ (MacExoIII, MacEndoQ)の解析を進めている。生化学的解析にのみならず、遺伝学的解析を行い、DNA損傷に対する感受性調べる予定である。
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