| 研究課題/領域番号 |
14J09702
|
|---|
| 研究機関 | 東京工業大学 |
|---|
研究代表者 |
平山 茜 東京工業大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
|
| キーワード | パクタマイシン / ピリドキサール 5'-リン酸 / ラジカルSAM酵素 |
|---|
| 研究実績の概要 |
パクタマイシン生合成遺伝子クラスター中には機能未知の酵素遺伝子が複数存在している。一昨年度までに、炭素五員環形成に直接関与し得る酵素と炭素環形成の前に働き得る酵素を選出し、大腸菌による異種発現を可能にしていた。そこで昨年度は、それらの酵素のin vitroでの反応を検討した。
炭素五員環の形成反応には酸化酵素が直接関与していると推定しており、候補となる酵素は2つあった。そのうちの一つであるPctPに関して、グリコシドの3位を酸化する活性を有することが種々の検討の結果明らかとなった。この酵素は、ピリドキサール5’-リン酸（PLP）依存型酵素であるPctCとともに酵素反応を行うことで、水酸基をアミノ基へと変換する役割を持つ。また、PctPとPctCによる反応を大スケールで行い、その反応生成物を単離して構造を明らかにした。これにより、炭素五員環形成酵素のもう一つの候補であるPctEが炭素環形成反応を担うことが強く示唆された。
続いて、PctPとPctCによる反応生成物がPctEによって変換されるかどうかをin vitroの実験により調べた。PctEは酸素に不安定なラジカルSAM酵素であると推定されるが、グローブボックスを利用することで、活性型と考えられる状態の精製酵素を得ることができている。この酵素を用いてもPctPとPctCによる反応生成物は変換を受けなかったことから、更なる修飾を受けた後に炭素環が形成されることが示唆された。これらの結果より、炭素五員環形成を担う酵素とその基質を絞り込むことができており、炭素環形成機構のin vitroでの反応解析を行う土台が整った。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、放線菌Streptomyces pactumが生産する抗腫瘍抗生物質であるパクタマイシンの炭素五員環骨格の形成機構の解明を目的として行っている。この目的の達成のためには、炭素五員環形成に関わる酵素とその基質を特定する必要がある。平成27年度の研究においては、炭素五員環形成酵素の候補であった2つの酵素のうちの1つが別の役割を担っていることを明らかにした。また、炭素五員環形成前に働く2つの酵素を特定したことで、炭素環形成反応の基質の構造を絞り込めた。これらの結果により、炭素五員環形成反応を検討する土台が整ったため、順調に進展していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、炭素五員環形成に直接関わると推定する酵素を大腸菌にて発現させ、精製酵素として得ている。また、炭素環形成反応の基質の構造を絞り込んでいる。そこで今後は、炭素環形成反応の基質の候補化合物を有機合成し、炭素環形成酵素との反応を検討する。炭素環形成酵素とその基質を明らかにした後は、速度論解析や点変異体酵素の反応解析等により、酵素反応機構を明らかにする。
|
