研究課題
骨格筋幹細胞は、増殖・分化して互いに融合することで新生筋線維(筋管)を形成して、筋成長・再生・肥大に貢献する。その活性変化には細胞内外の様々な因子を要求する。これまでに申請者は、分化期以降の筋幹細胞から多機能性細胞制御因子semaphorin 3A (Sema3A)が合成・分泌されること、その発現パターンは筋線維型依存的に異なることすなわち遅筋の筋幹細胞において速筋よりも高いことを突き止めた。これらの成果を受けて、「筋幹細胞から分泌されたSema3Aによる筋線維型自律制御機構」の存在という仮説を立てた。今年度は、培養細胞におけるSema3Aノックダウン実験系とSema3A欠損モデル動物を用いた実験系を作製して仮説の検証を行った。まず、RNAi法を用いてSema3Aをノックダウンすると筋管はControl区と同様に形成されるにも関わらず、遅筋マーカーslow MyHC (ミオシン重鎖)の発現量が減少して、速筋マーカーfast MyHCが増加することを突き止めた。よって、Sema3Aは筋管の遅筋化を誘導する生理機能を発揮することがわかった。また、この作用にはSema3Aの細胞膜受容体neuropilin 1および筋分化転写因子myogenin, MEF2Dの関与が認められた。興味深いことに、myogeninには筋線維型の制御作用がないと考えられてきたが、本研究ではmyogeninのノックダウン実験も行っており、筋管でslow MyHCの発現量が減少することを確認している。モデル動物の実験系として、筋幹細胞特異的にSema3Aをconditional knockout (cKO)したマウスの作製を進めている。マウスの系統が統一されていないことなどから充分なcKOには至っていないが、様々な問題点の修正が完了しており、早期の実験系の構築および表現型観察を目指している。筋線維型は運動神経支配によって決まると考えられているが、本研究成果より、筋幹細胞が自律的に筋管の筋線維型を「初期決定する」という新規性の高い考え方が導き出された。
2: おおむね順調に進展している
培養細胞におけるSema3Aノックダウンにより、筋管の筋線維型組成に変化が生じたこと並びにそのメカニズムの一端も明らかとなったため、当初の研究計画通りに進展している。Sema3A cKOマウスを用いたモデル動物実験では、今年度中の実験系の完成には至らなかったが、その原因追究を行うことで問題点解決のための方針が固まった。また、マウスのcKO誘発のための薬剤調製方法や投与の条件などの準備実験は完了している。
培養細胞を用いて、Sema3Aとは逆に筋管の「速筋化」を誘導する因子の探索・同定を行う予定である。その有力候補としてNetrinに着目している。その理由として、Sema3AとNetrinは共に神経軸索ガイダンス機能を有するがその作用は対局にあり、さらにNetrinはマウス由来筋芽細胞株C2C12からも合成されて筋管形成の促進作用を発揮する点が挙げられる。Netrinおよびその受容体の発現パターンを調べることから実験を開始して、機能解析については同様にノックダウン実験を行う予定である。動物実験に関しては、早期にSema3A cKOマウス実験系の作製を完了する予定である。充分なcKOが確認され次第、マウスの筋線維型組成・筋持久力・最大発揮張力などの生体レベルでの変化を観察するとともに、筋幹細胞の初代培養系を用いた細胞培養実験も同時に進める。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 1件)
Animal Science Journal
巻: 85 ページ: 994-1000
10.1111/asj.12264
International Journal of Biochemistry and Cell Biology
巻: 52 ページ: 272-285
10.1016/j.biocel.2014.05.032
栄養生理研究会報
巻: 58 ページ: 19-25
