| 研究課題/領域番号 |
14J10904
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
首浦 武作志 鳥取大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / ES細胞 / DNAメチル化 / ヒストン修飾 / 始原生殖細胞 |
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| 研究実績の概要 |
マウス初期胚や始原生殖細胞(PGC)で起こる、エピジェネティックリプログラミング機構を解明するため、リプログラミング活性をもつマウスES細胞を用いて研究を行ってきた。これまでに私達は、マウスES細胞におけるゲノム全体のDNAシトシンのメチル化(5mC)状態は、Dnmt酵素による5mC化およびTet酵素による5ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)化を起因とした脱メチル化が連続的に繰り返されていることで規定されることを見いだした。また、Tet酵素による5hmC変換領域はヒストン修飾の状態によって制御されていることを見いだした。本研究では、5mCから5hmCへの連続変換現象におけるDNAメチルトランスフェラーゼ(Dnmt)それぞれの役割を解明することを目指している。また、PGC分化過程におけるリプログラミング時のクロマチン状態の変化と、5hmC変換との相互関係を明らかにすることを目指している。
これまでに、Dnmt3a/3b欠損ES細胞(DKO ESC)において5hmCが著しく減少していたことから、5hmC変換の対象となる再メチル化はDnmt3a/3bによって行われることを明らかにした。また、Dnmt1/3a/3b TKO ES細胞(TKO ESC)にDnmt1をレスキューしたTKO+Dnmt1 ES細胞(TKO+Dnmt1 ESC)を用いた、エピブラスト様細胞(EpiLC)への分化誘導において、維持型のDnmt1しか残っていないにも関わらず、分化に伴い5mCレベルが上昇しており、Dnmt1に新規メチル化付加能があることを示唆する結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成26年度の研究から、Dnmt3a/3b欠損ES細胞(DKO ESC)からエピブラスト様細胞(EpiLC)への分化誘導において、5mCから5hmCへの変換が亢進していることがわかった。このことは、DKO ESC由来の分化細胞では、維持型のDnmt1しか残っていないにも関わらず、分化に伴い5mCレベルが上昇しており、Dnmt1に新規メチル化付加能があることを示唆することになる。DKO ESCではDnmt3a/3b欠損樹立よりも前の段階で付加されたヘテロクロマチン領域の5mCはTet酵素の変換の対象とならず、Dnmt1によって維持されている可能性がある。そこで、新たにDnmt1/3a/3b TKO ES細胞(TKO ESC)にDnmt1をレスキューしたTKO+Dnmt1 ES細胞(TKO+Dnmt1 ESC)を用いてDnmt1の新規メチル化付加能について解析を行った。未分化状態でのTKO+Dnmt1 ESCの5mCと5hmCの定量解析および染色体上の局在性の解析を行った。すると、未分化TKO+Dnmt1 ESCではほとんど5mCと5hmCは存在しないことがわかった。ES細胞はもともと低メチル化状態に保たれているため5mCが増加しなかったと考えられる。そこで、TKO+Dnmt1 ESCをゲノム全体のメチル化レベルが増加するEpiLCへと分化誘導を行うと、驚くべきことに分化4日目で5mCが増加しており、このことから、Dnmt1の新機能として、新規メチル化付加能があることが明らかとなった。この結果を、以下に示すよう研究成果を発表した：国際学会1件、国内学会・研究会3件、受賞1件。また、学会では、専門分野および共同研究者との情報交換や議論を行うこともできた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度には、Dnmt3a/3b欠損ES細胞(DKO ESC)をエピブラスト様細胞(EpiLC)に分化誘導すると5mC レベルが上昇することを見出した。DKO ESCには、維持型のDNAメチルとランスフェラーゼDnmt1しか残っていない。よって、この結果は、Dnmt1に新規メチル化能があることを強く示唆している。平成27年度は、Dnmt1が新規メチル化能をどの程度持つのか明らかにする目的でDnmt1/3a/3b 全てを欠損したTKO ESCにDnmt1を強制発現したES細胞株TKO+Dnmt1 ESCを用いて分化誘導実験を実施した。分化細胞における5mCおよび5hmCの定量解析や免疫染色による局在解析等から、Dnmt1に新規メチル化能があることを確認した。更にTKO+Dnmt1 ESCは未分化ESCではほとんど5mC化されないことから、Dnmt1の二重機能性は分化によって制御されていることも明らかになった。平成28年度は、TKO+Dnmt1 ESCの未分化と分化細胞を比較し、Dnmt1の新規メチル化活性を時期特異的に制御する機構解明を目指し、Dnmt1との共役因子の探索およびタンパク質の修飾について解析を行う。また、平成27年度までの研究成果を論文化する。
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