| 研究課題/領域番号 |
14J30003
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
中畑 義久 生理学研究所, 発達生理学研究系, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 神経損傷 / シナプス / FRETセンサー / 細胞内シグナル分子 / シナプス編成 / 培養神経細胞 / ライブセルイメージング |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、神経損傷後の軸索・樹状突起の再生とシナプス再編成に関与するシグナル伝達や分子輸送システムの関連を細胞レベルで明らかにすることを目的としている。そこで本研究では、ライブセルイメージングによって分子間の相互作用を可視化し、「分子同士の動き」という観点から、損傷後の神経細胞内でダイナミックに変化する分子動態を解析する。
損傷後の神経細胞では、細胞の生存および神経回路の再生・再編成のため、その形態がダイナミックに変化する。そのため、そうした細胞の形態を変化・維持させる細胞骨格を制御する低分子量GTPアーゼは、障害回復期における主な分子標的と考えられる。そこで、実施計画に基づき、本年度はFRETセンサーを付加したDNAコンストラクトを作製し、主にマウス大脳皮質由来の分散培養およびラット海馬由来の培養脳切片への遺伝子導入を行い、これらのFRETセンサーが神経細胞に発現することを確認した。
次年度からは、それらのセンサーを用いて神経損傷モデルにおける分子活性と細胞内局在、分子同士の相互作用について、網羅的に解析を進める。また、それらの分子のダイナミクスと神経活動の関連を解析するとともに、細胞の形態変化についても検討する。但し、神経活動と分子活性を同一細胞で可視化するためには、FRETセンサーによる蛍光測定とカルシウムイメージングを同時に行う必要がある。そのため、ライブセルイメージングと併せて、電気生理学的手法を用いることも検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
年次計画の通り、FRETセンサー付加DNAコンストラクトの作製と培養神経細胞への遺伝子導入を行い、二光子蛍光寿命イメージングによって低分子量GTPアーゼの活性を確認した。一方、分散培養細胞への遺伝子導入効率が低く、複数の導入方法を検討する必要が生じたことから、シナプス関連分子間の相互作用の解析はやや遅れている。しかし、培養脳切片を併用することでこの問題を改善できることから、おおむね計画通りに進められていると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に作製したFRETセンサーを神経損傷モデルに適用し、分子活性と細胞内局在、分子同士の相互作用について、網羅的に解析を進める。また、それらの分子のダイナミクスと神経活動の関連を解析するとともに、細胞の形態変化についても検討する予定である。
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