| 研究課題/領域番号 |
14J40145
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
鈴木 美穂 基礎生物学研究所, 形態形成研究部門, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | DNAメチル化 / ヌクレオソーム |
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| 研究実績の概要 |
ゲノム上のヌクレオソームの位置や安定性と、DNAメチル化にどのような関連があるかを明らかにするために、カタユウレイボヤの胚から核を精製し、MNase-seqを行った。その結果、１メチル化遺伝子のプロモーター領域はヌクレオソームが少ないオープンな領域であること、２メチル化遺伝子の転写伸長領域の方が非メチル化遺伝子の転写伸長領域よりヌクレオソームの密度が低いこと、３エクソン、イントロンともにヌクレオソームが巻き付いているDNA配列にはDNAメチル化が密集していること、を明らかにした。これらの結果から、DNAメチル化がヌクレオソームの位置決定や結合安定性に関与する可能性が示唆された。
次に、転写領域のDNAのメチル化が転写と転写共役スプライシング速度にどのような影響を与えているか調べるために、新生RNAを4sUでパルスラベルしたのち精製し、新生 RNA-seqを行った。現在、10分、30分パルスとtotal RNAの次世代シークエンスデータから、転写伸長スピードを解析中である。また、MNase-seqと新生RNA-seqの結果を合わせると、ヌクレオソームを含む100-300 bpのイントロンは、転写共役スプライシングの効率が悪く、切り出しに時間がかかっている様子が明らかになった。そして、メチル化遺伝子には、転写共役スプライシングの遅いイントロンが多く含まれていた。
最後に、来年度実施予定のビオチンタグ付きメチル化DNA結合タンパク質を発現させる実験について、予備実験を行った。カタユウレイボヤ受精卵に、ビオチンリガーゼ (BirA)とBirA認識配列タグをつけたDNA結合タンパク質を発現させるベクターをエレクトロポレーションで導入したところ、幼生ステージでビオチン化されたメチル化DNA結合タンパク質を発現させることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
第一年度目の計画どおり、カタユウレイボヤ胚を用いてヌクレオソーム解析を行い、メチル化と非メチル化遺伝子のクロマチン構造に違いがあることを示すデータを得ることができた。計画のヒストンChIPは今年度中には完了しなかったが、第二、三年度目の他の計画を先取りして進めているため、総合して研究は期待通り進展している。特に、新生RNA-seqのデータとヌクレオソームのデータを合わせることで、クロマチン構造とスプライシング効率の相関をゲノムワイドに明らかにしたことは重要な成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、阻害剤を用いてDNAメチル化を減少させることで、DNAメチル化がヌクレオソームの位置決定に関与しているかどうかを明らかにする。さらにDNAメチル化の減少がスプライシング速度の変化に与える影響を解析する。また、ビオチンタグ付きメチル化DNA結合タンパク質が結合しているゲノム領域を抽出し、次世代シークエンスで解析する計画である。
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