| 研究課題/領域番号 |
14J40214
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| 研究機関 | 名古屋工業大学 |
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研究代表者 |
吉住 玲 名古屋工業大学, 工学研究科, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| キーワード | 生物物理 / イオン輸送 / ロドプシン / 膜タンパク質 / 光受容 / ナトリウムポンプ |
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| 研究実績の概要 |
微生物型ロドプシンがポンプできるイオンはH+とCl-しかないと考えられてきたが、近年我々は海洋性細菌からNaCl中ではNa+、KCl中ではH+を細胞外側へポンプするハイブリッド型のロドプシン KR2を発見した。しかしながらKR2は発見されたばかりであり、輸送における(1)分子メカニズムおよび(2)生理的機能には不明な点が多い。
(1)分子レベルでの解析：高度好塩菌から発見された光駆動プロトンポンプ、BRではプロトン輸送に重要なAsp85とAsp96が、KR2ではそれぞれAsn112、Gln123という配列になる。このNQをもつロドプシンとして、KR2、NdR2、GlR2、IndiR2についてポンプ活性を測定したところ、いずれもNa+存在下ではNa+、K+存在下ではH+を優先的に細胞外側へ輸送していることが分かった。さらに外液のpHに依存して、H+輸送能に明らかな差がみられた。ポンプ活性におけるpH依存性はNaRに共通の性質であること、つまりNa+とH+の輸送は競合していることが明らかとなった。このようなハイブリッドなイオン輸送は、微生物型ロドプシンでは観測されておらず、光駆動ナトリウムポンプに特異な性質であることを示唆している。
(2)細胞レベルでの解析：海洋性細菌は難培養性であるため、これまで生細胞におけるロドプシンの機能測定はほとんど実現していなかった。まずNaRの遺伝子を有する微生物株2株をKorean Collection for Type Cultures (KCTC)よりより購入し、培養を行った。培養後、光駆動イオン輸送活性を測定したところ、1株はナトリウムポンプ活性のみ、もう1株はプロトン活性のみを示した。これは、近縁の微生物種であり、NaR、PRいずれも遺伝子を保有している株でありながら、その機能発現は異なることを示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)分子レベルでの解析
H26年度はロドプシンの機能転換に先立ち、4種の野生型NaRにおける性質の検討を行った。その結果、ポンプ活性におけるpH依存性はNaRに共通の性質であること、つまりNa+とH+の輸送は競合していることが明らかとなった。これはNa+とH+の輸送が同経路、または一部が共通である可能性を示唆しており、NaRのイオン輸送メカニズム、特にイオン選択性の解明に近づいたと考えている。
(2)細胞レベルでの解析
NaRの遺伝子を有する微生物株2株Nonlabens dokdonensis DSW-6、Indibacter alkaliphilus LW1ををKorean Collection for Type Culturesよりより購入し、培養を行った。培養後、光駆動イオン輸送活性を測定したところ、I. alkaliphilus LW1はナトリウムポンプ活性のみ、N. dokdonensis DSW-6はプロトン活性のみを示した。これは、近縁の微生物種であり、NaR、PRいずれも遺伝子を保有している株でありながら、その発現は異なることを示している。細菌においてNaR、PRがどのような生理機能を有しているのか、明らかにするための実験材料は整ったと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)分子レベルでの解析
BRにおいてシッフ塩基へのプロトン移動を担うD85とD96が、KR2ではそれぞれN112、Q123という中性化されたアミノ酸になっている。さらに、KR2におけるシッフ塩基のプロトンアクセプターはD116であることがわかっている。そこで「プロトンアクセプターの位置がKR2とBRでは異なることが、カチオン輸送のスイッチに重要である」と考え、N112に着目した解析を行う。イオン選択性については、大腸菌菌体を用いたポンプ活性を指標に検討する。
(2)細胞レベルでの解析
Krokinobacter 株はMB培地で培養でき、KR1、KR2それぞれのポンプ活性を確認している。しかしながら、発現誘導因子の検討は不十分であり、発現条件を最適化しているとは言いがたい。そこで、Krokinobacter 株において KR1、KR2が最も発現する条件を探索する。発現因子としては、培養時における光の有無、NaCl濃度、培地の栄養条件（特に炭素濃度）があげられるので、様々な条件で培養する。また、昨年度新たに購入したロドプシン遺伝子保有株Nonlabens dokdonensis DSW-6、Indibacter alkaliphilus LW1についても、同様の発現誘導因子の検討を行う。培養条件を変化させた菌体について、タンパク質レベルでの発現量はポンプ活性、mRNAレベルでの発現量はノーザンブロッティングやリアルタイムPCRにより検討する。得られた結果を基にして、KR1、KR2の発現制御機構について、考察を行う。
上記について得られた結果を取りまとめ、学会発表を行う予定である。
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