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2015 年度 実績報告書

新規光駆動ナトリウムポンプのイオン識別機構の解明と光操作技術への応用

研究課題

研究課題/領域番号 14J40214
研究機関名古屋工業大学

研究代表者

吉住 玲  名古屋工業大学, 工学研究科, 特別研究員(RPD)

研究期間 (年度) 2014-04-25 – 2017-03-31
キーワード生物物理 / イオン輸送 / ロドプシン / 膜タンパク質 / 光受容 / ナトリウムポンプ
研究実績の概要

2013年に発見されたばかりで不明な点が多い、新規光駆動ナトリウムポンプの(1)イオン識別機構を明らかにすること、(2)生理的機能の解明を目的としている。
(1)分子レベルでの解析:微生物型ロドプシンは「光吸収を担う発色団がプロトン化し正電荷をもつため、プロトン以外の正電荷をポンプするのは不可能」と考えられてきた。正電荷をもつNa+を輸送する際、一番の障壁となるのは、同じく正電荷を有するレチナールシッフ塩基の存在である。光反応のスイッチでもあるこの障壁を、どのように乗り越えているのかが問題となる。
東大院理・濡木研との共同研究で明らかとなったKR2の立体構造では、KR2の対イオンAsp116の位置は、酸性と中性において対イオンAsp116の配向が異なることが明らかとなった。そこで我々は、Asp116が配向を変化することでナトリウムの輸送経路を形成するフリップモデルを提唱した。Na+の輸送に対して最大の障壁となるレチナールシッフ塩基の正電荷がなくなるとともに、Asp116の配向変化によりナトリウムイオンの経路が形成されると考えたのである。ただし注意が必要となるのは、今回明らかとなった立体構造は、光反応中間体ではなく暗状態の酸性条件における構造ということである。このモデルの正しさを示すためには、配向変化で形成されるAsp116とAsn112、Ser70の水素結合の重要性を明らかにする必要があると考えた。変異体を用いたポンプ機能解析の結果、Asp116との水素結合を保持するN112DやS70Tはナトリウムイオンを輸送した一方、N112AやS70Aでは輸送能が失われ、Asp116との水素結合が輸送に必須であることが明らかとなった。
(2)細胞レベルでの解析:KR2を有するK. eikastusの近縁種N. dokdonesis DSW-6を培養し光駆動イオン輸送活性を測定した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

(1)分子レベルでの解析
H27年度は、KR2のイオン輸送機構特にカチオンの輸送メカニズムについて検討し、その結果、カチオンを輸送する際には対イオンであるAsp116のフリップモデルを提唱した。
変異体を用いたポンプ機能解析の結果、Asp116との水素結合を保持するN112DやS70Tはナトリウムイオンを輸送した一方、N112AやS70Aではナトリウムイオン輸送能が失わたが、プロトン輸送能が残っていた。これはKR2のナトリウムとプロトンのイオン識別機構に重要な知見を与えるものである。
(2)細胞レベルでの解析
KR2を有するK. eikastusの近縁種N. dokdonesis DSW-6をKorean Collection for Tyep Culturesより購入、培養し、光駆動イオン輸送活性を測定した。K. eikastusと同様にナトリウムポンプNaRとプロトンポンプPRの遺伝子を保有していながら、N. dokdonesis DSW-6株は非常に強いプロトンポンプ活性を示し、ナトリウムポンプ活性は検出できなかった。そこで、培養条件を検討することでNaRの発現条件を探索したところ、NaCl濃度に依存していることが明らかとなった。これはNaRの発現が、外的要因により制御されていることを示しており、NaRの生理的機能に知見を与えるものである。

今後の研究の推進方策

(1)分子レベルでの解析
Asp116の水素結合を形成するAsn112とSer70に着目し、変異体を用いたポンプ活性測定を行う。必要に応じて光反応サイクルも測定し、Asn112とSer70のイオン選択性における役割を明らかにする予定である。
(2)細胞レベルでの解析
N. dokdonesis DSW-6におけるNaRの発現制御に関する因子の探索、さらにPRの時期依存的なポンプ活性を測定する。得られた結果に対してい、それぞれに遺伝子の発現制御機構について、考察を行う。
上記について得られた結果を取りまとめ、学会発表を行う予定である。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Structural basis for Na+ transport mechanism by a light-driven Na+ pump2015

    • 著者名/発表者名
      Hideaki E. Kato, Keiichi Inoue, Rei Abe-Yoshizumi, et. al.
    • 雑誌名

      Nature

      巻: 521 ページ: 48-53

    • DOI

      10.1038/nature14322

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] The role of the NDQ motif in sodium-pumping rhodopsins2015

    • 著者名/発表者名
      Keiichi Inoue , Masae Konno, Rei Abe-Yoshizumi, and Hideki Kandori
    • 雑誌名

      Angew. Chem. Int.

      巻: 54 ページ: 294-296

    • DOI

      10.1002/anie.201504549

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Ultrafast photoreaction dynamics of a light-driven sodium-ion-pumping retinal protein from Krokinobacter eikastus revealed by femtosecond time-resolved absorption spectroscopy2015

    • 著者名/発表者名
      Shinya Tahara, Satoshi Takeuchi, Rei Abe-Yoshizumi, Keiichi Inoue, Hiroyuki Ohtani, Hideki Kandori, Tahei Tahara
    • 雑誌名

      J. Phys. Chem. Lett.

      巻: 6 ページ: 4481-4486

    • DOI

      10.1021/acs.jpclett.5b01994

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] 光駆動ナトリウムポンプKR2の多量体形成に関わるアミノ酸残基の同定2016

    • 著者名/発表者名
      吉住 玲、伊藤奨太、井上圭一、神取秀樹
    • 学会等名
      生物物理学会中部支部講演会
    • 発表場所
      岡崎
    • 年月日
      2016-02-29
  • [学会発表] Role of Asn112 for transport activity by a light-driven sodium ion pump2015

    • 著者名/発表者名
      Rei Abe-Yoshizumi, Keiichi Inoue, Hideaki Kato, Osamu Nureki and Hideki Kandori
    • 学会等名
      The 53rd annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • 発表場所
      金沢
    • 年月日
      2015-09-13 – 2015-09-15
    • 国際学会
  • [学会発表] 光駆動ナトリウムポンプKR2のポンプスイッチにおける2015

    • 著者名/発表者名
      吉住玲、井上圭一、加藤英明、濡木理、神取秀樹
    • 学会等名
      分子研研究会
    • 発表場所
      岡崎
    • 年月日
      2015-04-20 – 2015-04-21

URL: 

公開日: 2016-12-27  

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