一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15011205
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 桑原 正靖 群馬大学, 工学部, 助手 (40334130)
• キーワード: 核酸 / 有機化学 / バイオテクノロジー / 生体生命情報学

研究概要

酵素や抗体のような活性をもつDNAやRNAが試験管内選択法によって創製されている。このような機能を有する核酸分子(DNA/RNA)の更なる活性の向上や機能の多様化を狙って、タンパク質に見られる官能基を導入した修飾DNAに試験管内選択法を応用する試みがある。そのためには修飾核酸の簡便な酵素的合成法が必要である。これまでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって複数の修飾ヌクレオチドが導入された修飾DNAの酵素的合成は困難であった。本研究では耐熱性DNAポリメラーゼが触媒するPCRの基質となる修飾TTPと修飾dCTPおよび修飾dATPを合成した。複数の修飾ヌクレオシド三リン酸を用いてPCRアッセイを行ったところ、プロピニルリンカーをもつ修飾TTPとメチルアミドリンカーをもつ修飾dCTPを同時に用いた酵素反応系が最も収率よく二重修飾DNAを与えた。また、修飾DNAの酵素的合成に適したポリメラーゼの探索を行ったところ、遺伝子進化ファミリーBに属するKOD Dash DNAポリメラーゼとVent(exo-)DNAポリメラーゼが有用であることが分かった。これらの酸素-修飾基質反応系を用いたPCRにより、ヒドロキシル基やニトリル基、アミノ基、グアニジノ基などを有する二重修飾DNAを簡便に調製できる方法を確立した。次に、アミノ基が修飾されたDNAを用いてDNAのシングルミスマッチ構造を認識するアプタマーの創製を試みた。フルマッチ二重鎖をネガティブ・ターゲット、シングルミスマッチ二重鎖DNAをポジティブ・ターゲットとした試験管内選択法により、CAミスマッチを認識するものを選択する操作を繰り返したところ、ターゲットに結合する修飾DNAの割合は、1ラウンド目では全体の2.4%に過ぎなかったが、6ラウンド終了後には26%まで増加した。今後、目的の活性を持つ修飾DNAを単離し配列解析や機能評価を行う。

研究成果

• [文献書誌] Masayasu Kuwahara, Yumi Takahata, Atsushi Shoji, Akiko N.Ozaki, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai: "Substrate Properties of C5-Substituted Pyrimidine 2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate for Thermostable DNA Poltmerases during PCR"Bioorg.Med.Chem.Lett.. 13(21). 3735-3738 (2003)
• [文献書誌] Masayasu Kuwahara, Shin-ichi Hososhima, Yumi Takahata, Rina Kitagawa, Atsushi Shoji, Kazuo Hanawa, Akiko N. Ozaki, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai: "Simultaneous incorporation of three different modified nucleotides during PCR"Nucleic Acids Res.Suppl.. 3. 37-38 (2003)
• [文献書誌] 桑原正靖, 澤井宏明: "試験管内選択法による機能性修飾核酸の創製"未来材料. 9. 51-57 (2003)