蛋白質の活性に着目した、新しい網羅的遺伝子解析の試み

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15013240
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 水島 徹 岡山大学, 薬学部, 助教授 (00264060)
• キーワード: DNA複製 / ORC / DnaA / 活性 / DNAチップ / ゲノム

研究概要

本年度我々は、それぞれの活性を介して発現が変化する遺伝子の解析に必要な、ATP結合、重合、膜リン脂質結合、ATPase活性部位に変異を持つ、温度感受性dnaA変異株の作成を行った。具体的には、我々が同定したそれぞれの活性の機能ドメインにランダムに変異を導入し、温度感受性変異株を単離した。その後、その変異位置を同定するとともに、変異DnaAを精製し、目的の活性だけが特異的に欠損していることを確認した。このように作成した温度感受性dnaA変異株の内、重合活性に関する変異株とDNAチップ技術を用いて、変異により発現が変化する遺伝子の同定を行った。数多くの遺伝子が同定されたが、特にDnaKなど分子シャペロン関連の遺伝子が多かった。我々は、DnaAの重合に分子シャペロンが関与しているのではないかと考えている。一方我々はGST Pull-downアッセイを用いた方法で、DnaAの重合活性依存にDnaAに結合する蛋白質を検索した。既に知られているDnaA、DnaBなどの蛋白質に加え、興味深いことにやはり分子シャペロンが同定された。
一方我々は酵母の複製開始因子ORCに関してもこれまで、DnaAとの共通性という独自の観点から生化学的に研究してきた。その結果ORCもDnaA同様、ATP結合、ATPase、膜結合、重合など、様々な生化学的活性を持つ蛋白質であることが分かってきた。さらに本年度我々は、ORCもDnaA同様、ADPと高い親和性で結合し、ADP結合型ORCは不活性であることを発見した。そこでORCに関してもDnaAと同様の方法で、それぞれの活性を介した遺伝子ネットワークを明らかにすることが重要であると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Makise, M.: "Kinetics of ATP-binding to Origin Recognition Complex of Saccharomyces cerevisiae"J.Biol.Chem.. 278. 46440-46445 (2003)
• [文献書誌] Takahashi, N.: "Analysis on Origin Recognition Complex containing Orc5p with defective Walker A motif"J.Biol.Chem.. (in press).
• [文献書誌] Hoshino, T.: "Prostaglandin E_2 protects gastric mucosal cells from apoptosis via EP_2 and EP_4 receptor activation"J.Biol.Chem.. 278. 12752-12758 (2003)
• [文献書誌] Mizushima, T.: "Protection of gastric mucosal cells from apoptosis and necrosis by induction of HSP and PGE_2"Jpn.J.Hyperthermic Oncol.. 19. 67-78 (2003)
• [文献書誌] Tsutsumi, S.: "Molecular mechanism of adaptive cytoprotection induced by ethanol in human gastric cells"Exp.Biol.Med.. 228. 1089-1095 (2003)
• [文献書誌] Sekiya, H.: "Functional cloning and characterization of a multidrug efflux pump, MexHI-OpmD, from a Pseudomonas aeruginosa mutant"Antimicrob.Agents Chemother.. 47. 2990-2992 (2003)