テロメアの1本鎖DNA領域に結合する蛋白質Pot1の高次構造とテロメア調節機構

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15023253
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 鳥越 秀峰 東京理科大学, 理学部第一部, 講師 (80227678)
• 研究分担者: 緒方 一博 横浜市立大学, 医学部, 教授 (90260330)
• キーワード: テロメアDNA結合蛋白質 / テロメア1本鎖DNA / 結合活性 / 3次元構造 / 速度論的特性

研究概要

Pot1蛋白質をコードする遺伝子に一連の部分欠失変異を導入し、大腸菌内で大量発現するためのプラスミドを構築した。このプラスミドを大腸菌に導入し、一連の部分欠失変異体の遺伝子を大腸菌内で大量発現することに成功した。また、大量発現した一連の部分欠失変異体の蛋白質を単品にまで精製する系を確立した。この一連の変異型蛋白質と野生型テロメア1本鎖DNA領域との結合活性を解析し、Pot1のN末端側の182アミノ酸残基がテロメアの1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なDNA結合ドメイン(DBD)であることを明らかにした。また、一連の部分欠失変異を導入した様々な長さおよび領域の変異型テロメア1本鎖DNAを調製した。この一連の変異型テロメア1本鎖DNAと野生型Pot1 DBDとの結合活性を解析し、テロメア1本鎖DNAの6塩基GGTTACがPot1 DBDとの特異的な結合に必要な最小の長さであることを明らかにした。
Pot1 DBD単独の3次元構造を解析し、つのαヘリックスとつのβシートを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)foldに属する構造であることを明らかにした。また、テロメア1本鎖DNAの6塩基GGTTACとPot1 DBDとの結合過程の速度論的特性を生理条件で解析したところ、結合速度定数k_<assoc>は約10^4M^<-1>s^<-1>であり、解離速度定数k_<dissoc>は約10^<-2>s^<-1>であった。Pot1 DBDはテロメア1本鎖DNAと結合しやすく解離しやすいことを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Torigoe, H., Hari, Y., Obika, S., Imanishi, T.: "Triplex Formation Involving 2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) with 2-Pyridone Base Analogue"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 22. 1097-1099 (2003)
• [文献書誌] Torigoe, H., Hari, Y., Obika, S., Imanishi, T.: "Triplex Formation Involving 2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) with 1-Isoquinolone Base Analogue"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 22. 1571-1573 (2003)
• [文献書誌] Torigoe, H., Kawahashi, K., Tamura, Y.: "Promotion of Triplex Formation by Morpholino Modification : Thermodynamic and Kinetic Studies"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 157-158 (2003)
• [文献書誌] Torigoe, H., Katayama, T., Umegaki, Y.: "Thermodynamic Analyses of Purine Motif Triplex DNA Formation"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 159-160 (2003)
• [文献書誌] Torigoe, H., Akaike, T., Maruyama, A.: "Rational Combination of Strategies to Achieve Synergistic Stabilization of Triplex"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 221-222 (2003)