酵母のカルネキシン及びPDIホモログノックアウトが蛋白質の品質管理に及ぼす影響

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15032236
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 加藤 昭夫 山口大学, 農学部, 教授 (00035114)
• 研究分担者: 阿座上 弘行 山口大学, 農学部, 助手 (40263850)
• キーワード: カルネキシン / PDI / シャペロン / タンパク質品質管理 / 酵母S. cerevisiae

研究概要

酵母Saccharomyces cerevisiaeの膜結合型分子シャペロンであるカルネキシン、PDIホモログ(Eps1)が新生蛋白質の品質管理に関与することを証明するために、これらの分子シャペロンをノックアウトした酵母を作成し、リゾチームやシスタチンなどの不安定変異体をモデル蛋白質として、発現分泌させた。酵母のカルネキシンをノックアウトすることによって、アミロイド型変異リゾチームや不安定変異リゾチームが多量分泌することを明らかにし、この観察により、カルネキシンがタンパク質の品質管理に関与していることを明確に示した。また、酵母のカルネキシンのクローニングに成功し、その機能を詳細に調べた。その結果、カルネキシンはモデル蛋白質のリフォールドを促進するいわゆるシャペロン活性を示すが、モノグルコース型のハイマンノース糖鎖の存在下ではその機能は失われた。この観察は(1)カルネキシンのレクチンドメインが新生タンパク質との相互作用に必須であること。(2)新生タンパク質のフォールディングはレクチンドメインに近接した領域で行われることを示すものである。さらに、カルネキシンと同様に膜接合型分子シャペロンであるPDIホモログ(Eps1)をノックアウトした酵母を作成することに成功したので、この酵母を用いて、Eps1がSS結合を多く含む蛋白質(リゾチーム、シスタチン)の品質管理にどのような影響を及ぼすか検討したところ、Eps1ノックアウト酵母ではこれらのタンパク質が野生型酵母に比べ著しく分泌すること、また活性の低下したものが分泌していることが明らかになり、Eps1がSS結合を含むタンパク質の品質管理に関与していることが示された。

研究成果

• [文献書誌] S.Begum, A.Saito, A.Kato, J.He, H.Azakami: "Expression and characterization of chicken ovoinhibitor in Pichia pastoris"Nahrung. 47. 359-363 (2003)
• [文献書誌] A.Saito, Y.Sako, M.Usui, H.Azakami, A.Kato: "Functional properties of glycosylated lysozyme secreted in Pichia pastoris"Biosci.Biotech.Biochem. 67. 2334-2343 (2003)
• [文献書誌] S.T.Liu, A.Saito, H.Azakami, A.Kato: "Expression, purification, and characterization of an unstable lysozyme mutant in Pichia pastoris"Protein Expression and Purification. 27. 304-312 (2003)
• [文献書誌] 加藤昭夫, 川岸明彦, 河田康志, 内海成, 吉川正明, 山縣ゆり子: "タンパク質工学-生命科学系分野のための-"医学出版. 305 (2004)