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1.光架橋性官能基を有するコラーゲンモデルペプチドを用いたprotein-footprintによるHSP47のコラーゲン認識機構の解析
光架橋性アミノ酸残基(Bpa)を導入したコラーゲンモデルペプチドと精製したHSP47とを混合し、紫外線照射によりクロスリンクした。クロスリンク体の酵素消化断片の構造解析により、HSP47タンパク質上のコラーゲン結合部位をある程度絞り込むことができた。すなわち、HSP47のコラーゲン結合部位は、HSP47にひとつ存在するシステイン残基とは反対側の側面に位置することがわかった。また、3個のBpa残基を導入した3量体型コラーゲンモデルペプチドとHSP47とのクロスリンク実験の結果から、複数のHSP47分子が細いコラーゲントリプルヘリックスを取り囲むように結合するという、新たな複合体モデルが導かれた。
2.HSP47のシャペロン機能を証明する検出システムの開発
HSP47がコラーゲントリプルヘリックス構造の形成を直接促進するシャペロンであるか否かを検証するためには、HSP47共存下においてトリプルヘリックス形成をモニタできるin vitoのシステムを開発する必要がある。本研究では、末端に2個のシステイン残基を有するコラーゲンモデルペプチドが、トリプルヘリックス形成に依存して、空気酸化によりジスルフィド架橋されることを見出した。ジスルフィド架橋されたペプチドは逆相HPLCを用いて容易に分離・定量できるため、HSP47のシャペロン機能の解明に応用可能である。
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