機能ゲノム学的戦略による分子多様性の開拓

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15101007
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 海老塚 豊 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (90107384)
• 研究分担者: 渋谷 雅明 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (50170923) ; 藤井 勲 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (70181302)
• キーワード: 機能ゲノム学 / 天然物 / 生合成酵素 / トリテルペン / ポリケタイド / モデル植物 / 放線菌 / 糸状菌

研究概要

【新規トリテルペン合成酵素のクローニングと機能同定】
RT-PCR法により、シロイヌナズナから5種、オタネニンジンおよびシラカンバの培養細胞からそれぞれ1種、4種の新規トリテルペン合成酵素遺伝子を取得し、酵母の発現系により酵素機能の同定を試みた。これまで酵素機能の判明したシロイヌナズナ由来の3クローンは新規の骨格を含む複数の生成物を与える多機能型酵素であった。一方、オタネニンジン由来のクローンは、薬用ニンジンの主サポニンのアグリコンである4環性骨格のダンマランジオール-II合成酵素であり、組換え酵素による有用サポニン生産に価値の高いクローンである。シラカンバ由来のクローンはいずれも既知の生成物を与える酵素であったが、植物ステロール生合成系のサイクロアルテノール合成酵素が同一植物種に複数存在する最初の例となった。
【新規ポリケタイド合成酵素のクローニングと機能同定】
ベンゾイソクロマン系抗生物質生合成に関わるType-IIポリケタイド合成酵素の比較ゲノム学的展開として、メダマイシン生産株streptomyces sp. AM7161株より、29 ORFからなる約30kbの新規生合成クラスターを取得した。配列解析および異種放線菌における機能発現により、本クラスターがメダマイシンクラスターであると同定した。本クラスターを取得したことで、既知ベンゾイソクロマン系抗生物質生合成クラスター構成ORFとの組換えにより、生産可能な非天然型ハイブリッド抗生物質の分子種が飛躍的に増大した。
Str.albus, Str.neozarzinostaticusより、それぞれポリエーテル型、脂肪族ポリエノン型抗生質生合成に関わるポリケタイド合成酵素遺伝子を取得し、親株の遺伝子破壊実験により、それぞれサリノマイシン、ネオカルジリン生合成酵素であると同定した。
2種の糸状菌Phoma sp., Alternaria solaniより、それぞれ芳香族型、還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子を計5種取得し、異種糸状菌および酵母における機能発現を試みた。

研究成果

• [文献書誌] H.Zhang, M.Shibuya, S.Yokota, Y.Ebizuka.: "Oxidosqualene Cyclases from Cell Suspension Cultures of Betula platyphylla var.japonica : Molecular Evolution of Oxidosqualene Cyclases in Higher Plants."Biol.Pharm.Bull.. 26. 642-650 (2003)
• [文献書誌] Y.Ebizuka, Y.Katsube, T.Tsutsumi, T.Kushiro, M.Shibuya: "Functional Genomics Approach to the Study of Triterpene Biosynthesis."Pure Appl.Chem.. 75. 369-374 (2003)
• [文献書誌] K.Ichinose, M.Ozawa, K.Itou, K.Kunieda, Y.Ebizuka: "Cloning, Sequencing and Heterologous Expression of the Medermycin Biosynthetic Gene Cluster of Streptomyces sp. AM-7161 towards Comparative Analysis of the Benzoisochromanequinone Gene Clusters."Microbiology. 149. 1633-1645 (2003)
• [文献書誌] M.Izumikawa, M.Murata, K.Tachibana, Y.Ebizuka, I.Fujii: "Cloning of Modular Type I Polyketide Synthase Genes from Salinomycin Producing Strain of Streptomyces albus."Bioorg.Med.Chem.. 11. 3401-3405 (2003)
• [文献書誌] H.Maruyama, S.Okamoto, Y.Kubo, G.Tsuji, I.Fujii, Y.Ebizuka, K.Furihata, Hayakawa, H.Nagasawa, S.Sakuda: "Isolation of Abikoviromycin and Dihydroabikoviromycin as Inhibitors of Polyketide Synthase Involved in Melanin Biosynthesis by Colletotrichum lagenarium."J.Antobiotics. 56. 801-804 (2003)
• [文献書誌] M.Ozawa, T.Taguchi, T.Itoh, Y.Ebizuka, K.I.Booker-Milburn, G.R.Stephenson, K.Ichinose: "Structure and Biosynthetic Implication of (S)-NHAB, a Novel Shunt Product, from a Disruptant of the actVI-ORFA Gene for Actinorhodin Biosynthesis in Strepeomyces coelicolor A3(2)."Tetrahedron. 59. 8793-8798 (2003)