真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズム

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15107003
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 杉野 明雄 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 教授 (90231737)
• 研究分担者: 岡部 勝 大阪大学, 遺伝情報実験センター, 教授 (30089875) ; 和賀 祥 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助教授 (60222402) ; 川崎 泰生 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助手 (30243257)
• キーワード: pre RC (複製開始名複合体) / Mcm蛋白 / Cdc / Dbf4 protein kinase / GINS / Polε複合体 / アフリカツメガエル卵粗抽出液 / セントロメア / 複製開始

研究概要

1)G1期に同調した出芽酵母細胞抽出液を用い染色体DNA複製開始部位を含むプラスミドDNA上でpre RC複合体を形成をさせた。このpre Rc複合体とCdc7/Dbf4 protein kinaseと保温するとpre RC中のMcm2p及びmcm4pが定量的にリン酸化されることを示した。しかしMcm2pのCdc7/Dbf4 protein kinaseによるリン酸化が複製開始には必須ではなく、Cdc7/Dbf4蛋白複合体がMcm2pに結合し、複製開始部位に結合したMcm2-7複合体の構図変化を起こすことが重要であることが示された。
2)pre RC複合体形成及びS-CdKやCdc7/Dbf4 protein kinaseによるpre RC複合体の活性化によって起こると考えられる複製開始部位の二本鎖DNA鎖解裂反応、そしてその後の複製DNAポリメラーゼ複合体の複製開始部位へのローディング反応の再構成を行なう目的で、本年度、新に単離同定された複製開始に必須なGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3複合体)の精製を行なった。この複合体がPolε複合体と直接相互作用することをin vitroで証明した。
3)アフリカツメガエル卵粗抽出液が行なうin vitro染色体DNA複製系を使って、複製開始反応に必須の働きをしているGINS蛋白複合体がCdc45蛋白、DPB11蛋白などと協調してPol ε複合体を複製開始部位にロードすることを明らかにした。
4)マウス、及びヒトセントロメア領域の複製がS期の中期に行われることを明らかにした。しかし、セントロメア領域を含む人工染色体では、S期の後期に複製されることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Leem, S-H.: "The possible mechanism of action of ciclopirox olamine in the yeast Saccharomyces crerevisiae"Mol.Cells. 15・1. 55-61 (2003)
• [文献書誌] Araki, Y.: "Budding yeast mcm10/dna43 mutant requires a novel repair pathway for viability"Genes to Cells. 8・5. 465-480 (2003)
• [文献書誌] Takayama, Y.: "GINS, a novel multiprotein complex required for chromosomal DNA replication in budding yeast"Genes & Development. 17・9. 1153-1165 (2003)
• [文献書誌] Tsubota, T.: "Double-stranded DNA binding properties of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase ε and of the Dpb3p-Dpb4p subassembly"Genes to Cells. 8・11. 873-888 (2003)
• [文献書誌] Hashimoto, K.: "Fidelity of DNA Polymerase δ Holoenzyme from Saccharomyces cerevisiae : The Sliding Clamp Proliferating Cell Nuclear Antigen Decreases Its Fidelity"Biochemistry. 42・48. 14207-14213 (2003)
• [文献書誌] Furukohri, A.: "Identification and Characterization of a Xenopus Homolog of Dbf4, a Regulatory Subunit of the Cdc7 Protein Kinase Required for the Initiation of DNA Replication"J.Biochem.. 134・3. 447-457 (2003)