| 研究分担者 |
川崎 泰生 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助手 (30243257)
岡部 勝 大阪大学, 遺伝情報実験センター, 教授 (30089875)
関 丘 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 講師 (40271118)
奥野 友紀子 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助手 (00372524)
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| 研究概要 |
G1期で同調した出芽酵母細胞粗抽出液を用いたin vitro preRC複合体形成系の改良を行ない、効率のよいORC,Cdc6,Mcm2-7,Cdt1(Tah11)蛋白のARS部位のローディング反応を確率した。この系を用い、CRC及び、Cdc6がARS領域にロードされた後、Mcm2-7-Cdt1(Tah11)複合体がCdc6依存的にARS領域にロードされることを明らかにした。一方、G1期またはG2/M期で同調した出芽酵母細胞粗抽出液からMcm2-7-Cdt1複合体の精製に成功した。こうして精製したMcm2-7-Cdt1複合体はDNAヘリカーゼ活性は検出できないが、複製フォーク様(バブル構造やY構造)DNAに特異的に結合することが出来ることが明らかになった。また、Two-Step-Reconstitution法による出芽酵母染色体複製開始反応の再構成実験を可能にする目的で、Cdc45-Sld3,Dpb11-Sdd2,S-Cdk(Cdc28-Cln6),GINS複合体の多量精製方法を確立した。一方、アフリカツメガエル卵粗抽出液のin vitro染色体DNA複製系の解析を行ない、in vitro再構成実験に向けて、既に発現精製されたアフリカツメガエルDNAポリメラーゼε複合体、GINS,Cdc45,Cut5蛋白の蛋白-蛋白相互作用を検討し、新しくCdc45蛋白が単独で直接DNAポリメラーゼε複合体と結合することを初めて明らかにした。最後にマウスのDNAポリメラーゼε触媒サブユニットをコードする遺伝子muPOLE領域(〜8Mb)中の複製開始部位の同定単離を行なった。また既に確立されているヒト人工染色体(MAC)上の複製開始点のマッピングをDNA combing法を用いて行なった。
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