プロテオミクスを応用した細胞表層におけるプロテオリシスの網羅的標的解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15209011
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 清木 元治 東京大学, 医科学研究所, 教授 (10154634)
• 研究分担者: 泉 友則 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員(常勤形態) (00261694) ; 簗 幾勇 東京大学, 医科学研究所, 講師 (70332583)
• キーワード: Matrix metalloproteinase / MT1-MMP / Proteolysis / Membrane proteins / proteomics / nano-LC-MS / MS

研究概要

近年、細胞表層で起こるプロテオリシスが細胞機能の発現に深く関与することが明らかとなり、細胞表層での基質分解を担う分子群ネットワークの解明は、癌をはじめとする種々の疾病の解明に重要な手がかりとなりうる。
これまでに私たちは細胞外基質分解性のメタロプロテアーゼと癌浸潤に注目して研究を行った過程で、癌細胞の浸潤や転移に重要な役割を果たす膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT-MMP)を見出した。その後の解析からMT-MMPは癌細胞が基底膜からの浸潤・転移する際の基底膜破壊だけでなく、様々な疾病においても重要であることが明らかとなった。しかし、MT-MMPの膜上での機能制御の分子機構、およびその生理的な基質については、膜蛋白質の扱い難さ、検出法の限界などの理由により殆ど明らかとなっていない。そのため、細胞膜上で起こっているMT-MMPの制御分子や質分子を同定することは、これら分子がMT-MMPと共益的に新たな機能発現に関わる可能性、さらにヒト疾患の理解と診断治療への展望を開く可能性をもつ。
そこで本年度は、細胞表層のプロテアーゼシステムに着目して、膜型マトリックスメタロプロテアーゼ1 (MT1-MMP)と複合体を形成している細胞外および細胞内蛋白質を特異的に精製する実験系を確立した。まず、薬剤誘導によりMT1-MMP発現を制御可能な蛋白質発現系を用いて、FLAGタグ標識したMT1-MMPを安定的に発現誘導可能なヒト癌細胞株の樹立を行った。さらに、確立したMT1-MMP発現細胞を用いて、MT1-MMP複合体分子群の単離・精製を行い、この複合体に含まれる蛋白質を網羅的にプロテオーム解析システムによって解析し、その妥当性を既知の複合体形成分子を含んでいるか否かの判定を行い、これまでにMT1-MMPと結合が報告されている膜蛋白質を含め100種以上のMT1-MMP結合蛋白質を見出した。現在、免疫沈降法を用いて、今回見出された蛋白質のMT1-MMPとの結合の査定を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Nakamura H., et al.: "Constitutive and induced CD44 shedding by ADAM-like proteases and membrane-type matrix."Cancer Res.. 64. 876-882 (2004)
• [文献書誌] Uekita T., et al.: "Membrane-type 1 matrix metalloproteinase cytoplasmic tail binding protein-1 (MTCBP-1) is a new member of the Cupin superfamily : A possible multifunctional protein acting as an invasion."J.Biol.Chem.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Komori K., et al.: "Absence of mechanical allodynia and Abeta-fiber sprouting after sciatic nerve injury in mice lacking membrane-type 5 matrix metalloproteinase."FEBS Lett.. 557. 125-128 (2004)
• [文献書誌] Matsuda A., et al.: "Clusterin, an abundant serum factor, is a possible negative regulator of MT6-MMP/MMP-25 produced by neutrophils."J.Biol.Chem.. 278. 36350-36357 (2003)
• [文献書誌] Matsuki H., et al.: "Monoclonal antibodies with defined recognition sequences in the stem region of CD44 : detection of differential glycosylation of CD44 between tumor and stromal cells in tissue."Cancer Res.. 63. 8278-8283 (2003)
• [文献書誌] Ueda J., et al.: "Sequence-specific silencing of MT1-MMP expression suppresses tumor cell migration and invasion : importance of MT1-MMP as a therapeutic target for invasive tumors."Oncogene. 22. 8716-8722 (2003)