| 研究課題/領域番号 |
15300127
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
高橋 正身 北里大学, 医学部, 教授 (10318826)
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| 研究分担者 |
高垣 洋太郎 北里大学, 医学部, 教授 (50281324)
中村 和生 北里大学, 医学部, 講師 (40189030)
東 貞宏 北里大学, 医学部, 助手 (80348507)
片岡 正和 信州大学, 工学部, 助教授 (90332676)
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| キーワード | EGF / NGF / IGF-1 / 成長因子 / 神経伝達物質 / 開口放出 / SNAP-25 / 特異抗体 |
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| 研究概要 |
SNAP-25はVAMP-2、syntaxinと共にSNAREタンパク質複合体を形成し、神経伝達物質放出を伴う開口放出機構の中心的な役割を果たしている。これまでに我々はPC12細胞にNGFを作用させるとSNAP-25のSer^<187>リン酸化が亢進し、細胞膜へのSNAP-25の移行が促進されることを明らかにしてきた。SNAP-25にはExon5のスプライシングバリアントであるSNAP-25aとSNAP-25bの2種類のアイソフォームが存在するが、それらが脳内でどのように局在し、どのような機能的な役割分担を果たしているかは明らかにされていなかった。本年度我々はSNAP-25aおよびSNAP-25bに対する特異抗体を作成し解析を行った。抗体の作成にはSNAP-25aとbにおいてアミノ酸配列に差異のあるExon5の合成ペプチドを抗原としてウサギで作成し、抗原ペプチドを架橋した2段階のアフィニティーカラムで精製した。得られた抗体の特異性は抗原ペプチドを用いたELISAとSNAP-25aおよびSNAP-25bを発現させたHEK293細胞のイムノブロットで確認した。ラット脳のホモジネートを細胞分画しイムノブロットで調べたところ、SNAP-25aとbは異なる分布を示すことが明らかとなった。様々な週齢のマウスの脳のイムノブロット解析から、発生過程においてSNAP-25bタンパク質は経時的に発現が増加していくのに対し、SNAP-25aタンパク質は発生7日付近を最大として一過的に発現が増大することが明らかとなった。さらにマウス脳の免疫組織化学解析から、SNAP-25bタンパク質は脳内の広範囲にわたり存在するのに対しSNAP-25aタンパク質は海馬のCA3と小脳の顆粒層など特定の領域に局在していることが明らかになった。以上の結果からSNAP-25aとbは脳内で異なった分布を示し、何らかの機能分担を果たしていることが考えられた。
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