|
新しいCYP1A1誘導機構に関与している遺伝子CREMが我々のグループによって同定された。その役割を明らかにするため、CYP1A1遺伝子の発現調節領域にCREMが関与する配列を、リポーター遺伝子による転写活性化を指標にして同定した。この配列にはBTE(basic transcripton element)が含まれていることが明らかとなった。そこで、BTBに結合する因子として同定されているSp1の結合に関与するヌクレオチドに変異をいれて、リポーター遺伝子アッセイを行ったところ、顕著な転写活性化の減少が認められる変異配列が存在した。
さらに、この配列に結合する因子が存在するかどうかをEMSA (electromobility shift assay)法により検討した。HepG2細胞の核から抽出してきた蛋白質を、^<32>P標識したオリゴヌクレオチドとインキュベートした後、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ラジオオートグラフィーによって検出した。明らかなバンドが複数本認められ、^<32>P標識されていない大過剰のプローブを加えることによって消失したことから、特異的なバンドであることが確認された。また、このバンドは、定常状態の細胞から抽出した核蛋白質にも認められるが、オメプラゾール処理をした細胞では強いバンドとして認められた。このことから、CREMはSp1を含む複合体を形成して転写の活性化に関与している可能性が考えられた。現在CREMのsiRNAを用いてHepG2細胞でgene silencingを誘導し、CYP1A1の誘導発現へのCREMの関与をin vivoで確認する実験を行っている。
|
