| 研究概要 |
RasおよびRhoファミリー低分子量GTP結合蛋白質の情報伝達反応の時間・空間的様相を、細胞内で主として1分子計測法を用いて明らかにすること、RasやRhoファミリーG蛋白質が細胞の中で、何時、何処で活性化されているか、活性化されたG蛋白質とそのエフェクターとの結合・解離のキネティクスおよび、細胞内における分子ダイナミクスなどを、我々の開発した細胞内1分子計測法等可視化解析技術を使って明らかにすることを目的とし研究を行った。G蛋白質は細胞の増殖、分化、細胞運動や細胞の形態形成において重要な役割を果たしている。
本年度は、RasとそのエフェクターであるRaf1の相互作用計測を行った。RafにはRBD(Ras binding domain),CRD(Cystein rich domain)という2つのRasGTP結合部位によって、RasGDP(不活性型)とRasGTP(活性型)を区別していると考えられていた。さらにCRDとRasGTPの結合には、Rafの構造変化を必要とすると言われている。我々はRaf1のRBD,RBD-CRD domainあるいはCRDの点突然変異体にGFPを融合させて細胞内に発現し、Rasとの相互作用時間を1分子解析した。その結果、RBD,RBD-CRDはともにRasGDPとRasGTPを見分けることができないこと、RasGTPは積極的にRafの構造変化を誘起してRafと強固に結合すること。RasGTPとRafの結合後にさらに未知の中間状態が形成されること。中間状態の形成とその後のRasGTPとRafの解離反応速度は、Rafのリン酸化によって変化することなどを示唆する結果を得た。
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