疾病特異的な酸化傷害タンパク質検出法の開発と応用

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15310141
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 小寺 義男 北里大学, 理学部, 講師 (60265733)
• 研究分担者: 大石 正道 北里大学, 理学部, 講師 (40233027) ; 前田 忠計 北里大学, 理学部, 教授 (90265728)
• キーワード: タンパク質 / プロテオーム解析 / 酸化傷害

研究概要

酸化傷害タンパク質検出試薬の開発と検出法の確立
酸化傷害タンパク質検出用試薬TOP (Tags for Oxidized Proteins)を開発した。この試薬はタンパク質中のアルデヒド基と特異的に反応するreactive groupと、酸化傷害タンパク質を精製・濃縮するためのaffinity tagを安定同位体標識可能なlinker regionでつないでいる。組織から抽出したタンパク質混合物に[1]TOPを付加し、[2]affinity columnで精製後、[3]液体クロマトグラフィーまたは電気泳動で分離する。[4]分離したタンパク質を酵素消化して酸化傷害タンパク質を同定するとともに、酸化傷害部位を質量分析計で直接検出する。linker regionに安定同位体標識したTOPを用いることにより、疾病組織と正常組織に含まれる酸化傷害タンパク質量を定量比較するとともに、傷害部位を知ることが出来る。人為的に酸化傷害を与えたペプチドに対して上記の[1]〜[4]の方法を確立し、アルデヒド化されたペプチド成分だけを質量分析計で解析することに成功した。
本年度気付いた問題点と今後の展開
酸化に伴うペプチドの分子量変化は非常に多岐にわたることがわかった。これはペプチド中のそれぞれのアミノ酸が様々な酸化を受けることに起因している。解析を困難にした点はそれぞれの酸化状態で質量分析時のイオン化効率が異なる点である。このため、どの酸化状態がどのくらい含まれているか、という定量的な解析は不可能であった。また、タンパク質の解析においてもこの多様な酸化状態にともなう質量分析スペクトルの広幅化が質量分析を困難にした。来年度はこの点を解決するために定量性のある検出法と質量分析計を組み合わせて進める。

研究成果

• [文献書誌] Lee CW, Kim S, Roh SH, Endoh H, Kodera Y, Maeda T, Kohno T, Wang JM, Swartz KJ, Kim JI.: "Solution structure and functional characterization of SGTx1,a modifier of Kv2.1 channel gating"Biochemistry. 43. 890-897 (2004)
• [文献書誌] Kuruma H, Egawa S, Oh-Ishi M, Kodera Y, Maeda T: "Proteome analysis of prostate cancer"Asian J.Androl. (In press). (2004)
• [文献書誌] 0h-Ishi M, Ueno T, Maeda T: "Proteomic method detects oxidatively induced protein carbonyls in muscles of a diabetes model Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rat"Free Radic.Biol.Med.. 34. 11-22 (2003)
• [文献書誌] 前田忠計, 大石正道, 上野剛, 小寺義男: "糖尿病ラット筋肉における酸化傷害タンパク質の検出"J.Mass Spectrom.. 51. 509-515 (2003)
• [文献書誌] 大石正道, 小寺義男, 前田忠計: "遺伝性疾患モデル動物を用いた疾患プロテオーム解析"J.Mass Spectrom.. 51. 516-523 (2003)
• [文献書誌] 前田忠計, 大石正道, 小寺義男: "ゲノミクス・プロテオミクスの新展開(監修:今中忠行)"(株)エヌ・ティー・エス. (2004)